血管紧张素（1～7）对2型糖尿病大鼠胰岛形态及功能的影响

王 丽，何军华，吴慧璐，程 瑞，范运娟

研究表明，胰腺中表达肾素－血管紧张素系统（RAS），阻断肾素－血管紧张素系统可减少糖尿病的发生率。近年来发现了肾素－血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的生理拮抗剂血管紧张素（1～7）［Ang（1～7）］。本研究通过Ang（1～7）干预，探讨在整体状态下阻断肾素－血管紧张素系统对2 型糖尿病（T2DM）大鼠胰岛形态、功能及胰腺局部氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 180g～220g 雄性清洁级Wistar大鼠36只，普通标准饲料（由山西医科大学实验动物中心提供）喂养2周，测体重。随机选取12只为正常对照（NC）组，普通饲料喂养。24 只予以高糖高脂饲料（10%猪油、10%蛋黄、20%蔗糖、60%普通标准饲料）喂养，8 周后一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）40mg／kg（STZ以0.1mol／L、pH4.4的柠檬酸钠缓冲液配置）制作T2DM 模型。正常对照组以普通饲料喂养8周后腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液。1周后尾静脉采血测空腹血糖（FBG），非同日两次FBG≥16.7mmol／L 且观察期间血糖未出现明显下降为T2DM 模型制作成功，共20只，随机分为糖尿病对照（D0）组、Ang（1～7）［300μg／（kg·d）］干预（D1）组，每组10只。D0组以等量的生理盐水颈部皮下注射，连续8周，仍以高糖高脂饲料喂养。

1.2 实验方法及检测指标

1.2.1 大鼠体重、血糖浓度的测定 分别于饲养前、STZ注射前后每周用电子秤测体重（武汉自动化仪表厂生产），并分批进行大鼠尾静脉采血（采血前大鼠禁食10h）测血糖浓度（美国强生血糖仪）。

1.2.2 苏木精伊红（HE）染色进行胰腺病理形态学观察 实验末各组大鼠用25%乌拉坦麻醉，腹主动脉采血后，迅速摘取完整的胰腺组织，置于冰冷的PBS液中漂洗，除去血液并仔细分离多余的脂肪组织。取相同部位的胰腺组织做石蜡切片，每个蜡块切片5张，用二甲苯脱蜡、梯度酒精复水后用苏木精和伊红染色，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在Olympus光学显微镜高倍（×400）视野下定性观察，胰岛内细胞数目，细胞的形态，细胞膜的完整性，细胞核的大小、形态。

1.2.3 免疫组织化学指标检测 将胰腺组织放入4%多聚甲醛中固定48h，再依次脱水、透明、浸蜡、包埋及切片，采用免疫组织化学染色，在Olympus光学显微镜下观察，胞浆染色呈褐色颗粒者视为阳性表达。每个指标各切5张，将每张切片随机编号，在高倍（×400）下双盲观察6个～8个视野，选择胰岛部分用计算机图像处理系统进行平均光密度检测，并量化分析。

1.2.4 血清AngⅡ及胰岛素水平的测定 STZ注射9周后，25%乌拉坦麻醉大鼠，腹主动脉采血2mL 静置后，3 000r／min离心10min，取上清液－70 ℃冰箱保存。大鼠AngⅡ及胰岛素均严格按照其ELISA 试剂盒说明操作。

1.2.5 稳态模型胰岛素抵抗指数（Homa－IR）测定运用李 光 伟 法［1］，Homa－IR＝（FBG×FINS）／22.5，FINS为空腹胰岛素。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件分析。数据用均数±标准差）表示。组间差异采用单因素方差分析，组间均值比较采用LSD 法，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠胰腺胰岛细胞HE 染色形态学观察结果 从HE 染色病理切片可见NC 组大鼠胰岛呈圆形，胰岛细胞排列规律，呈索状排列，胰岛细胞胞质浅染呈粉红色，胞核密集，窦隙血管腔大。D0组胰岛细胞排列稀疏不均，细胞形态不一，大部分细胞核淡染，胞浆疏松呈空网状，胞浆淡染，不清晰，梁索间的窦隙血管腔明显变小，部分处于近乎闭塞状态。D1组胰岛细胞排列不整齐，大鼠胰岛β细胞体积增大，核染色质清晰，胞浆丰富，呈淡红染细颗粒状，窦隙血管腔变小。

2.2 胰岛免疫组化结果

2.2.1 胰岛素免疫组化染色分析 与NC 相比，D0组β细胞内胰岛素相对浓度（IRC）显著下降（P ＜0.01），表明D0组大鼠胰岛素贮备不足。干预后，D1组与D0组比较，细胞内胰岛素相对浓度有所增加（P ＜0.05）。详见表1。

2.2.2 胰岛内诱导型NO 合酶（iNOS）表达水平 与NC相比，D 0组胰｛JP 3岛iNOS相对浓度显著增加（P ＜0.01），增加了43.5%；D1组iNOS表达较D0组显著降低（P ＜0.05），降低了19.4%，但仍较NC 组高（P ＜0.01）。详见表1。

表1 各组大鼠胰岛免疫组化结果量化分析

表1 各组大鼠胰岛免疫组化结果量化分析

与NC组比较，1）P ＜0.01；与D0组比较，2）P ＜0.05。

组别 n IRC iNOS NC组 12 0.47±0.03 0.35±0.03 D0组 10 0.22±0.011） 0.62±0.041）D1组 10 0.34±0.012） 0.50±0.052）

2.3 Ang（1～7）对大鼠血糖、体重的影响（见表2）干预结束后与D0组相比，D1组大鼠体重差异无统计学意义，但D0组、D1组体重均低于NC组（P ＜0.01）。STZ注 射 后 第9 周 末，与NC 组 比 较，D1 组、D0 组FBG 明显升高（P ＜0.01），与D0组比较，D1组FBG有所降低（P ＜0.05）。

2.4 大鼠血清AngⅡ及胰岛素含量的变化（见表2）

2.4.1 大鼠血清AngⅡ的表达水平 与NC 组相比，D0组血清AngⅡ含量明显升高（P ＜0.01），与D0组相比，D1组AngⅡ水平显著降低（P ＜0.05）。

2.4.2 大鼠血清胰岛素含量的变化 造模9周后，与NC组相比，D 0组与D 1组血清胰岛素均明显降低（P＜0.01）；与D0组相比，D1组血清胰岛素增加（P＜0.05）。

2.5 Homa－IR 的变化（见表2） 造模9周后，与NC组相比，D 0组与D 1组血清Homa－IR均明显增加（P＜0.01），与D0组相比，D1组血清Homa－IR降低（P ＜0.05）。

表1 干预后各组大鼠FBG、FINS、Homa－IR、AngⅡ的比较

表1 干预后各组大鼠FBG、FINS、Homa－IR、AngⅡ的比较

与NC组比较，1）P ＜0.01；与D0组比较，2）P ＜0.05。

组别 n 体g重mmol／L mIU／L Homa－IR ng／mⅡL NC组 12 331.8±14.5 5.43±0.50 15.73±1.43 3.78±0.39 2.72±0.13 D0组 10 234.6±15.01） 19.60±1.311） 8.01±1.131） 6.98±1.011） 3.70±0.191）D1组 10 231.3±10.61） 13.03±0.801）2） 10.65±0.841）2） 6.17±0.691）2） 3.47±0.111）2）

3 讨 论

近年来T2DM 与RAS 系统关系备受关注。T2DM 是一种慢性进展性疾病，胰腺β细胞功能缺陷是其发生发展的主要病理生理学特征。胰腺中存在局部的RAS［2］及RAS中新的物质如Ang4、Ang（1～7）、血管紧张素转换酶2（ACE2）新的受体Mas。其中Ang（1～7）是由天冬氨酸、精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、组氨酸、脯氨酸组成的七肽。AngⅡ在ACE2的催化下生成Ang（1～7），一方面降低了AngⅡ的含量，另一方面其催化产物Ang（1～7）与受体Mas结合可起到拮抗AngⅡ的作用，即舒张血管、抗炎、抗组织纤维化、抗氧化应激等［3，4］，Ang（1～7）参与几乎所有RAS系统的调节机制［5，6］。有研究表明，Ang（1～7）－Mas受体轴可能参与糖耐量异常和胰岛素抵抗的发生［7］，但其在胰岛中的具体作用机制尚不明确。长期高血糖状态可使局部RAS活性增强，RAS 活化后可通过诱导细胞凋亡、增强氧化应激及血流动力学的改变等引起胰岛结构和功能进一步损害。本研究采用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素腹腔注射建立T2DM 大鼠模型，发现T2DM 大鼠血清AngⅡ增加，胰岛形态较正常对照组明显异常，细胞内胰岛素分泌颗粒减少，胰岛功能下降，胰岛素抵抗指数增加。通过Ang（1～7）干预后发现，阻断RAS可改善胰岛细胞的形态、增加胰岛β细胞内胰岛素的分泌颗粒，改善胰岛素抵抗。提示胰岛素分泌减少可能与长期胰岛素抵抗作用下胰岛β细胞受损有关，胰岛β细胞形态结构的改变必将影响胰岛功能。RAS的活化也可能参与了T2DM 大鼠胰岛形态和功能的损伤，给予AngⅡ生理拮抗剂Ang（1～7）后降低T2DM 大鼠FBG 的同时明显改善其胰岛的形态和提高β 细胞胰岛素的储备，进一步改善T2DM 大鼠胰岛素抵抗水平。

胰岛β细胞的凋亡和功能障碍与T2DM 有密切关系［8］。经典的RAS通路ACE－AngⅡ－AT1过度激活，可以诱导氧化应激，影响细胞能量代谢，导致细胞凋亡。以往的研究证实，RAS阻断可保护胰岛β细胞免受氧化应激损害，进而改善胰岛素的合成和分泌。iNOS在氧化应激中起到重要作用，胰岛局部iNOS表达增加可导致NO 水平增加从而使氧化应激反应增强，可引起胰岛β细胞功能下降及β细胞凋亡信号被大量激活。本研究发现，与正常对照组相比，T2DM 大鼠胰岛iNOS水平升高，通过阻断RAS后，胰岛局部iNOS减少。因此推测糖尿病状态下拮抗RAS后，减少了局部的氧化应激水平，减轻了炎症反应，减少了炎症因子的表达，有利于胰岛氧气及营养物质的供应，进而减少了β细胞的损害及凋亡，进一步改善了胰岛形态和β细胞功能。

本研究从形态学和功能学的角度初步证实Ang（1～7）干预可改善T2DM 大鼠胰岛形态，优化胰岛功能，减少胰岛局部氧化应激。表明胰腺局部RAS的活化在T2DM 的发展过程中起到重要作用，为临床糖尿病患者胰岛β细胞的保护提供了新的靶点，但Ang（1～7）与胰岛β细胞形态和功能的关系及其具体分子机制还待进一步研究。

［1］ 李光伟，潘孝仁，Lillioja S，等.检测人群胰岛素敏感性的一项新指数［J］.中华内科杂志，1993，32：656－660.

［2］ Paul M，Poyan Mehr A，Kreutz R.Physiology of local renin－angiotensin systems［J］.Physiol Rev，2006，86：747－803.

［3］ Dhaunsi GS，Yousif MH，Akhtar S，et al.Angiotensin－（1－7）preents diabetes－induced attenuation in PPAR－γand catalase activities［J］.Eur J Pharmacol，2010，638：108－114.

［4］ Rabelo LA，Alenina N，Bader M.ACE2－angiotensin－（1－7）－Mas axis and oxidative stressin cardiovascular disease［J］.Hypertens Res，2010，34（2）：154－160.

［5］ Sastos RA，Ferreira AJ，Simles E，et al.Recent advances in the angiotensin－converting enzyme 2－angiotensin（1－7）－Mas axis［J］.Exp Physiol，2008，93（5）：519－527.

［6］ Trask AJ，Averill DB，Ganten D，et al.Primary role of angiotensin enzyme－2in cardiac production of angiotensin－（1－7）in transgenic Ren－2hypertensive rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，292（6）：3019－3024.

［7］ Bindom SM，Lazartigues E.The sweeter side of ACE2：Physiological evidence for a role in diabetes［J］.Mol Cell Endocrinol，2009，29（302）：193－202.

［8］ Kaufman RJ.Beta－cell failure，stress，and type 2diabetes［J］.N Engl J Med，2011，365：1931－1933.