术前血清miR-221水平对肝细胞肝癌R0切除术后早期复发的预测价值*

郭晓东，余灵祥，李瑞生，周艳贤，郭超楠，杨美

·短篇论著·

术前血清miR-221水平对肝细胞肝癌R0切除术后早期复发的预测价值*

郭晓东，余灵祥，李瑞生，周艳贤，郭超楠，杨美

目的探讨肝细胞癌（HCC）患者术前血清miR-221水平与R0切除术后患者生存和早期复发的关系。方法选取2009年7月至2011年8月在我院行R0切除术治疗的78例HCC患者，采用实时荧光定量RT-PCR法检测血清miR-221水平，并分析血清miR-221水平与HCC患者临床和病理特征的关系。结果38例高分化HCC患者血清miR-221水平为（6.4±2.2），而39例低分化患者为[（11.5±4.3），P＜0.05]，13例血清AFP＜20μg/L患者血清miR-221水平为（5.9±3.6），而65例血清AFP＞20μg/L患者为[（9.6±2.9），P＜0.05]，而在不同性别、年龄、肝硬化有无、肿瘤大小、Child-Pugh分级间无明显差异（P＞0.05）；78例HCC患者在R0切除术后血清miR-221相对水平（3.49±0.73）较术前（8.95±1.57）显著降低（P＜0.05）；高水平组1 a生存率为45.3%（24/53），低水平组为72.0%（18/25，P＜0.05）；高水平组平均疾病进展时间（TTP）和中位生存期（MOS）分别为10.7个月和14.2个月，而低水平组则分别为15.3个月和19.2个月，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论血清miR-221水平与HCC患者临床和病理特征密切相关，其术前血清高水平提示HCC患者在R0切除术后仍预后不良。

肝细胞癌；肝切除术；miR-221；预后

Hepatocellular carcinoma；Hepatectomy；miR-221；Prognosis

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，每年全球大约有70万人死于HCC[1]。手术切除肿瘤仍然是目前最有效的治疗手段。R0指在显微镜下切缘无癌细胞的完整肿瘤切除，即所谓的根治性切除，理论上获得R0切除的患者可以获得较长的生存期。但由于术前或术中可能存在肝癌细胞的微转移等原因可导致术后早期肿瘤复发[2]。“理想”的HCC标志物有利于我们有效评估手术切除效果，以及判断术后肿瘤复发或转移。目前，临床上最常用的用于HCC复发和预后的血清学标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）存在一定的假阳性或假阴性的情况[3]。因此，寻找一种在敏感性和特异性方面都令人满意的反映HCC预后的标志物仍是目前研究的重点和热点。miRNA是新近发现的一类在真核生物中广泛存在的非编码调控单链小分子RNA。最新的研究显示，血液循环中肿瘤相关miRNAs还能作为恶性肿瘤诊断的生物学标志物[4]。miR-221是目前已知的在HCC患者癌组织中高表达的miRNA，且能在血清中检测到，与HCC的发生和预后密切相关[5]。本研究通过检测HCC患者在R0切除术后血清miR-221水平的变化，以探讨其与患者生存和早期复发或转移的关系。

1 资料与方法

1.1 病例来源选取2010年7月至2012年8月在我院行R0切除术治疗的78例HCC患者，所有患者均经组织病理学检查证实为HCC。其中男性61例，女性17例；年龄42～67岁，平均年龄（48.7±7.2）岁。术前AFP＞20 μg/L者65例，AFP≤20 μg/L者13例。所有患者均获得完整随访，且未在术后30 d内死亡。患者纳入标准：①病灶数≤3个，肿瘤最大直径≤10 cm；②肿瘤包膜或假包膜完整；③无肉眼可见的血管癌栓和区域淋巴结转移；④无远处转移；⑤肝功能Child-Pugh A级或B级；⑥术中经超声检查证实剩余肝无残留肿瘤，且病理学检查证实手术切缘无肿瘤细胞残留。本研究获得患者及其家属签署知情同意书，并经医院伦理委员会审核通过。

1.2 血清miR-221水平检测应用RT-PCR法，所有患者均在R0切除术前1～3 d及术后1个月空腹采集静脉血5 ml，置于含有促凝剂和明胶的试管中，置于室温下1 h。然后，在3000 r/m条件下离心15 min，将上层血清转移至洁净的EP管中，置于-80℃冰箱待测；根据mirVana PARIS Kit（AMl 556）提取试剂盒提供的方法提取血清RNA。采用NanoDropTM测定RNA水平并评估纯度，选取OD260/OD280值在1.9～2.1之间的样本进行下一步实验。选取U6作为内参基因，建立15 μl反转录体系：即dNTP 0.15 μl，Multiscribe RT enzyme 1 μl，Buffer 1.5 μl，RNase Inhibitor 0.19 μl，Nuclease free water 4.16 μl，RT Primer 3 μl，RNA 5 μl。在Gene Amp PCR System 9700上进行RT反应：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min，在反应结束后，冰上冷却5 min，-20℃保存。Realtime PCR反应：以U6为内参基因，建立20 μl反应体系：即TaqMan miRNA Assay 1 μl，Product from RT reaction 2 μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10 μl，Nuclease free water 7 μl。反应条件设置为：95℃，3 min；再95℃，15 s；60℃，30 s；72℃，30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCT法分析miR-221水平。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料采用（±s）表示，各组间数据差异分析采用配对t检验，采用Kaplan-Meire法计算TTP和OS，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC患者不同临床和病理学因素情况下血清miR-221水平比较经RT-PCR扩增，曲线为典型的“S”型，其融解曲线成单峰，表明扩增产物单一。将PCR扩增后的终产物进行凝胶电泳，结果显示为单一清晰的条带，大小和设计片段相同，证实为特异性扩增。RT-PCR结果显示，HCC患者血清miR-221水平在不同AFP水平和肿瘤分化程度方面存在显著的统计学差异（P＜0.05），而在不同性别、年龄、肝硬化有无、肿瘤大小、Child-Pugh分级间无明显差异（P＞0.05，表1）。

表1 HCC患者术前血清miR-221水平分层分析

2.2 R0切除术前后HCC患者血清miR-221水平变化HCC患者在R0切除术前血清miR-221水平的相对值为（8.95± 1.57），在R0切除术后1 m，HCC患者血清miR-221水平的相对值为（3.49±0.73），较术前明显降低（P＜0.05）。

2.3 R0切除术前血清miR-221水平与患者预后的关系术后随访患者至2013年10月，平均随访（23.7±7.4）个月，中位随访时间为21个月。按术前HCC患者血清miR-221水平分组，将78例HCC患者分为miR-221高水平组53例和低水平组25例。至随访截止时，高水平组1 a生存率为45.3%（24/53），低水平组为72.0%（18/25，P＜0.05）；高水平组平均疾病进展时间（TTP）和中位生存期（MOS）分别为10.7个月和14.2个月，而低水平组则分别为15.3个月和19.2个月，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

由于患者在术前或者术中可能有肿瘤细胞通过血液和/或淋巴系统转移至远处组织器官而成为术后复发的根源，因而即使是R0切除，术后也存在早期肿瘤复发的问题。如果能在早期发现肿瘤复发并及时采取治疗，可以延长患者的生存时间，改善预后[6]。AFP是最常用的预测HCC术后复发的指标。研究显示[7]，血清AFP＞20 μg/L是HCC根治性切除术后早期复发的风险因素之一。然而，大量的临床数据显示，HCC患者血清AFP水平不尽相同，甚至存在AFP阴性的HCC患者[8]。此外，肝炎、肝硬化、生殖细胞肿瘤、胰腺癌或肺癌等患者亦可出现不同程度的AFP升高。因此，单纯依靠AFP不利于HCC的早期诊断和判断术后早期复发或转移[9]。

miRNA是一类长度为20～25 nt，不编码蛋白质的单链小RNA。miRNA能够与靶基因mRNA的3'-UTR（untranslated region）区的碱基互补配对，使其降解或抑制其表达，从而导致特定基因的沉默，进而参与机体各种重要的生理和病理过程。最近的研究发现，miRNA在肿瘤的早期诊断和治疗等方面表现出良好的潜能。血清肿瘤相关miRNA与肿瘤的发生、发展、复发、转移以及预后密切相关[10]。miR-221是新近发现的一个肿瘤相关miRNA，其在肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤中表达均明显上调[11～13]，其致癌机理可能通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的表达，来调节细胞周期和增殖能力，抑制细胞分化和凋亡，从而促进肿瘤的发生和发展[14～15]。

本研究将HCC患者血清miR-221水平与HCC临床和病理因素之间的关系进行比较分析发现，HCC患者血清miR-221水平在AFP和肿瘤分化程度方面差异有统计学意义，提示血清miR-221与HCC的发生和肿瘤恶性程度存在一定的关联，这与前面相关文献的报道是一致的，也间接验证了miR-221具有抑制肿瘤细胞分化的能力。

HCC患者术后早期复发的预测对于提高HCC患者手术治疗效果有着至关重要的意义。我们将术前HCC患者分成miR-221高水平组和低水平组，通过随访发现，术前血清miR-221高水平提示较高的早期复发可能，且其平均疾病进展时间和中位生存期也明显低于低水平组，提示血清miR-221水平在判断HCC预后上有一定的意义。因此，对于术前血清miR-221高水平患者，术后应积极进行系统治疗，并严格监测肿瘤的复发情况，及早发现并进行必要的处理。

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（收稿：2013-12-30）

（校对：陈宗炳）

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.028

国家“十二五”重大专项（2012ZX10002003-004-006）

100039北京市解放军第三〇二医院

郭晓东，男，32岁，医学硕士，主治医师。主要从事肝病诊断与治疗工作。E-mail:guoxd_1981@163.com

Serum miR-221 levels predicts short-term survival after R0 resection in patients with hepatocellular carcinomaGuo Xiaodong，Yu Lingxiang，Li Ruisheng，et al.302nd Hospital，Beijing 100039