海藻酸钙-活性炭固定化好氧反硝化施氏假单胞菌生物脱的研究

叶斯斯，蒋张亮，炼石金，陈 勇，赵肖为，周茂洪

(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)

叶斯斯，蒋张亮，炼石金，陈 勇，赵肖为，周茂洪†

(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)

以采自温州西片污水处理厂曝气池的活性污泥样品中分离获得的好氧反硝化施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）WZUF25研究对象，分析其在最适宜条件下在人工污水中菌体生长和去除进程及反硝化占总氮去除率；采用海藻酸钙-活性炭包埋法固定Pseudomonas stutzeri WZUF25，研究固定化细胞在最适宜条件下去除进程和完整性．研究得出：Pseudomonas stutzeri WZUF25的脱能力明显比目前报道的好氧反硝化菌强，其海藻酸钙-活性炭固定化细胞去除人工污水的过程中，固定化胶珠是完整的．

施氏假单胞菌；固定化；海藻酸钙-活性炭；好氧反硝化

氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮在内的“三氮”以及重金属是目前地下水的普遍污染物，水体的氮污染不仅可引起水体富营养化，还可直接影响动物及人体的健康．脱氮是污水处理过程中的一个重要环节，传统理论认为生物脱氮必须经过好氧硝化和缺氧反硝化两个过程，因此传统脱氮技术在实际操作中受到许多限制．近30年来，国内外大量的研究报道证明好氧反硝化菌的存在，且发现大多数好氧反硝化菌表现异养硝化的特性[1]．异养硝化-好氧反硝化的发现为生物脱氮提供了全新的途径，使同步硝化/反硝化成为可能．因此，研究有着良好的生物相容性和较高生物脱氮效率的好氧反硝化细菌并运用于实践，对生物脱氮工程有着重大意义．

20世纪80年代，Robertson和Kuenen[2]在除硫和反硝化处理系统中，首次分离出好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha（现更名为脱氮副球菌Paracoccus denitrifications[3]）．此后，国内外研究者不断有从不同生态环境中分离获得好氧反硝化菌并研究其好氧反硝化特性的报道[4-11]．目前发现好氧反硝化现象仅在细菌中存在，主要存在于假单胞菌属（Pseudomonas）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoccus）和芽孢杆菌属（Bacillus）等土壤、水体常见种属中[12]．围绕Thiosphaera pantotropha开展的关于好氧反硝化的酶系也被较深入地研究[13]．围绕好氧反硝化菌在废水生物处理、养殖废水处理和降解有机物等方面的应用也有报道[14-16]，但总的来说主要停留于实验室研究，未真正应用于实践．

传统的污水生物处理工艺以微生物悬浮态生长的活性污泥处理法为主．固定化细胞技术用于废水生物处理与传统的悬浮生物处理法比较具有明显的优点，该项技术在废水生物处理尤其是在特种水处理领域进行了广泛的研究．近年来，固定化硝化菌脱氮技术已经从实验室和小规模试验阶段进入大规模的生产性试验阶段，已有许多公开专利[17-18]，而固定化好氧反硝化菌脱氮技术还处于实验室和小规模试验阶段．

本文报道了采用海藻酸钙-活性炭包埋法固定采自温州西片污水处理厂曝气池的活性污泥中分离获得的施氏假单胞菌，并对固定化细胞脱进行了研究．

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）WZUF25，由温州大学细胞工程实验室自温州西片污水处理厂曝气池的活性污泥中分离获得．

1.1.2 培养基

LB培养基（g·L-1）：酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂18，pH 7.0．

1.2 方 法

1.2.1 游离细胞生长和去除NO3--N进程测定

将保藏菌株（2.0 ml冷冻管融化的菌液）接种于装有200 ml LB液体培养基的500 ml锥形瓶中，在30℃、160 rpm下培养24 h，在5 000 rpm下离心10 min得菌体，并用无菌蒸馏水洗涤菌体2次，用无菌水制成菌悬液（OD6800.900 – 1.000）．然后按5%体积比的接种量转接于装有200 ml人工污水的500 ml锥形瓶中，在适宜条件下培养，定时取样测定OD680，然后在8 000 rpm下离心10 min后测定上清液和浓度，计算去除率和积累量．去除率/%=（起始浓度－结束浓度）/起始浓度×100，起始浓度和结束浓度均为三个平行样的平均值．

采用酚二磺酸法分光光度法[19]．

1.2.3 游离细胞反硝化占总氮去除率测定

将保藏菌株（2.0 ml冷冻管融化的菌液）接种于装有200 ml LB液体培养基的500 ml锥形瓶中，在30℃、160 rpm下培养24 h，在5 000 rpm下离心10 min得菌体，并用无菌蒸馏水洗涤菌体2次，用无菌水制成菌悬液（OD6800.900 – 1.000），然后按5%体积比的接种量接入装有200 ml人工污水的500 ml锥形瓶中．将接种后的培养基在8 000 rpm下离心10 min，测定上清液的浓度，计算总氮量；沉淀用凯氏定氮法测定菌体总氮量；两者之和表示起始总氮量．另将接种后的培养基在30℃、150 rpm – 160 rpm下培养24 h，在8 000 rpm下离心10 min后得上清液和菌体；测定上清液的和浓度和体积，计算培养结束后培养基总氮量；沉淀用凯氏定氮法测定菌体总氮量；两者之和表示培养结束后总氮量．反硝化占总氮去除率/%=（起始总氮量－结束总氮量）/起始总氮量×100，起始总氮量和结束总氮量均为三个平行样的平均值．

1.2.4 海藻酸钙-活性炭固定化细胞制备及固定化细胞去除试验

2 结果与讨论

2.1 游离细胞生长与去除NO3--N进程

在以往的报道①专利, 申请号: 201310375037.8, 本团队前期研究成果, 专利在申请阶段, 尚未公开.，已研究清楚施氏假单胞菌WZUF 25的耐受度为2 g·L-1KNO3、最适宜碳源为丁二酸钠、丁二酸钠和KNO3的适宜重量比为10∶2、适宜温度为20℃ – 40℃、适宜pH 为5 – 9、适宜摇床转速为100 rpm – 200 rpm．按方法1.2.1将菌液接入人工污水后在30℃、160 rpm下培养，定时取样测定生物量（OD680）、和浓度，计算去除率，结果见图1．

图1 施氏假单胞菌WZUF 25在人工污水中生长和去除进程

近30年来，国内外陆续报道从不同生态环境中筛选到好氧反硝化菌，它们的生理生态性能和脱氮能力均不相同．如杨小龙等[11]从鱼塘水样中分离到1株异养硝化-好氧反硝化的不动杆菌（Acinetobacter sp.），以KNO3为唯一氮源的培养液中，可在24 h内将培养液中从161.61 mg·L-1降至55.69 mg·L-1，去除速率为4.41 mg·L-1h-1．又如朱月琪等[21]从土壤中分离得到一株好氧反硝化细菌泛养副球菌（Paracoccus pantotrophus），该菌株在厌氧和好氧条件下均具有反硝化能力，硝酸盐氮初始浓度为137.25 mg/L，30 h内硝酸盐氮去除率分别为99.98%（厌氧）和60.16%（好氧）．Jibin Zhang等[22]从猪粪污水中分离获得1株异养硝化-好氧反硝化的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri YZN-001），在30℃下去除的速率为10.99 mg·L-1h-1．本文报道的分离自温州西片污水处理厂活性污泥的施氏假单胞菌WZUF 25在最适条件下，其去除的速率为16.31 mg·L-1h-1，显然其脱能力明显比目前报道的好氧反硝化菌强．

2.2 游离细胞反硝化占总氮去除率

按方法1.2.2进行反硝化占总氮去除率试验，结果见表1．菌株WZUF25在适宜条件下，反硝化占总氮去除率为52.576±1.719%．由此可知反硝化过程中，接近一半氮源被菌体利用来生长．

表1 反硝化占总氮去除率

按方法1.2.3制备海藻酸钙-活性炭固定化细胞胶珠，胶珠细胞密度约2.5×109个/胶珠 – 3.0 ×109个/胶珠，并分别以50粒胶珠/100 ml和100粒胶珠/100 ml接入人工污水后在30℃、160 rpm下培养，定时取样测定和浓度，计算去除率，结果见图2和图3．

图2 固定化细胞去除人工污水中的进程(50粒皎珠/100 ml)

图3 固定化细胞去除人工污水中的进程(100粒胶珠/100 ml)

由图2可以看出，接入50粒胶囊/100 ml培养24 h后去除率趋于稳定；浓度由起始的0.208 mg·ml-1降至0.014 mg·ml-1，去除率为93.27%，去除速率为8.08 mg·L-1h-1．在12 h时积累达到最大，至24 h 时已降至1 μg·ml-1以下．

由图3可以看出，接入100粒胶囊/100 ml培养12 h后去除率趋于稳定；浓度由起始的0.208 mg·ml-1降至0.013 mg·ml-1，去除率为93.75%，去除速率为16.25 mg·L-1h-1．在9 h时积累达到最大，至16 h时已降至1 μg·ml-1以下．固定化细胞去除人工污水的过程中，固定化胶珠是完整的．

包埋固定化是目前使用最为普遍、最为有效的一种细胞固定化方法，海藻酸钙凝胶包埋法具有凝胶珠粒制备方便、细胞固定量较高、对微生物毒性小等优点，但其具有凝胶机械强度不够的缺陷；为克服此不足，可在凝胶中加瓷圈、硅砂、面布、多空载体等支持物，以增加凝胶强度和沉降性[20]．本文采用的海藻酸钙-活性炭包埋法制备的假单胞菌固定化细胞，在文中给出的条件下的试验表明是稳定的，即培养结束后，固定化胶珠是完整的，但在实际应用中的稳定性（包括胶珠的完整性、重复使用性等）尚有待继续研究．

3 结 论

研究了好氧反硝化的Pseudomonas stutzeri WZUF25在最适宜条件下，在人工污水中菌体生长和去除进程及反硝化占总氮去除率，以及海藻酸钙-活性炭包埋法固定化的可行性，获得如下结果：

（1）在适宜条件下，Pseudomonas stutzeri WZUF 25在人工污水中培养12小时后去除率达到95.50%，去除速率为16.31 mg·L-1h-1，且去除与生长是同步的，积累小于1 μg·ml-1；

（2）反硝化占总氮去除率为52.576±1.719%；

（3）在50粒胶珠/100 ml接种量下，海藻酸钙-活性炭固定化细胞在人工污水中培养24 h后去除率为93.27%，去除速率为8.08 mg·L-1h-1，积累小于1 μg·ml-1；在100粒胶珠/100 ml接种量下，海藻酸钙-活性炭固定化细胞在人工污水中培养12 h后去除率为93.75%，去除速率为16.25 mg·L-1h-1，积累小于1 μg·ml-1；

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Research on Biological Removal ofwith Aerobic enitrifying Pseudomonas Stutzeri Immobilized in Calcium Alginate and Activated Carbon

YE Sisi, JIANG Zhangliang, LIAN Shijin, CHEN Yong, ZHAO Xiaowei, ZHOU Maohong
(College of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)

This paper takes the aerobic denitrifying Pseudomonas stutzeri WZUF25, which was isolated fromactivated sludge collected samples of Wenzhou West Sewage Treatment Plant as the object of study. The study analizes the thallus growth, the course ofremoval and denitrification’s contribution to total nitrogen removal in the artificialwastewater, when it is in the most suitable conditions; and then using calcium alginate and activated carbon embedding immobilize Pseudomonas stutzeri WZUF25, to study the immobilized cells for removing theprocess and integrity in such conditions. The results show that: The ability of Pseudomonas stutzeri WZUF25 removing theproves significantly better than the current reported and the immobilized cells are complete in the process of removingin the artificialwastewater.

Pseudomonas stutzeri; Immobilization; Calcium Alginate and Activated Carbon; Aerobic Denitrification

X703

A

1674-3563(2014)04-0055-07

10.3875/j.issn.1674-3563.2014.04.009 本文的PDF文件可以从xuebao.wzu.edu.cn获得

(编辑：封毅)

2014-03-26

温州大学2013年学生科研立项(226)；温州大学大学生创新创业训练计划(JWDC2012044)

叶斯斯(1991- )，女，浙江永嘉人，研究方向：环境微生物学．† 通讯作者，zhoumh@wzu.edu.cn