猪细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立

崔宇超，彭永刚，马兴杰，崔尚金*

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，临床症状以死胎和母猪流产为主要特征[1]。目前，PCR是检测PPV的一种主要技术。此外还有环介导等温扩增法(LAMP)[2]和荧光定量PCR方法[3-4]。这些方法均是为了提高现有PCR的敏感性，但荧光定量PCR需要昂贵的定量PCR仪，LAMP容易形成气溶胶污染，这些缺点限制了其在临床中的简便应用。因此，本研究针对PPV VP2基因，建立一种快速、敏感、特异的纳米PCR检测技术。

1 材料和方法

1.1 病毒核酸和病料样品 猪的主要病毒核酸包括PPV BQ-C株DNA，猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)SH株DNA，猪捷申病毒(PTV-8)cDNA，猪伪狂犬病毒(PRV)JL株DNA，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HB株cDNA，猪瘟病毒(CSFV)cDNA均由本实验室保存；病料样品为黑龙江、河北和河南3个省份的43份临床疑似PPV感染组织样品，主要包括发病猪的心、肝、脾、肺、肾等组织。

1.2 主要试剂 PrimeSTARRHS DNA高保真酶、DL2000 Marker、DNA A-Tailing Kit、pMD18-T 载体、E.coliDH5α感受态细胞、2×GC bufferⅡ购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；胶回收试剂盒购自AXYGEN公司；纳米PCR试剂盒购自山东大正医疗器械股份有限公司。

1.3 引物设计 参照GeneBank中登录的PPV BQ株序列的VP2基因，应用Oligo6.0软件设计扩增PPV VP2基因全长序列的引物，通过与已公布的VP2基因全长序列进行比对后筛选保守区域设计扩增472 bp片段的引物。引物由哈尔滨博士生物公司合成(表 1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 VP 2重组质粒模板的制备 以PPV BQ-C株细胞培养物提取的DNA为模板，以P1/P2为引物，利用PrimerSTAR高保真酶扩增VP2基因全长序列，并将其克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pMD-VP2，测序正确后作为PCR的阳性模板。

1.5 纳米PCR的建立以及条件优化 根据文献[5]的方法，将纳米PCR反应体系预设定为：2×nano buffer 6 μL，P3/P4(10 μmol/L)0.6 μL，pMD-VP2(100 ng/μL)0.8 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O补至12 μL；反应条件预设定为：94℃5 min；94℃30 s、50℃30 s、72℃40 s，30个循环；72℃7 min。普通PCR反应体系中，缓冲液为不含有纳米颗粒的2×GC bufferⅡ，同时添加dNTP，其他的反应试剂和反应条件与优化的纳米PCR相同。

利用温度梯度PCR仪设置温度为46℃～55℃，间隔1℃，进行退火温度优化，反应体系和其他反应条件均相同。引物(初始浓度为10 μmol/L)的使用体积从 0.2 μL 到 1.2 μL 进行优化，间隔 0.2 μL，优化的各组引物的终浓度为1/6 μmol/L～6/6 μmol/L，反应条件以优化后的退火温度为准。

1.6 敏感性试验 阳性模板测定浓度后根据浓度计算拷贝数，10倍倍比稀释后得到浓度梯度标准品。分别利用纳米PCR和普通PCR对倍比稀释的阳性模板进行扩增，以比较二者的敏感性。重复4次。

1.7 特异性试验 应用纳米PCR分别对PPV、PCV2和PRV的DNA以及PTV-8、PRRSV和CFSV的cDNA进行检测，以此验证纳米PCR方法的特异性。试验重复进行4次。

1.8 纳米PCR与普通PCR对临床样品的检测比较将43份临床组织样品分别剪碎、研磨，参照基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，分别应用纳米PCR和普通PCR对提取的DNA进行检测。

2 结 果

2.1 阳性模板的制备 以PPV细胞培养物提取的DNA作为模板，扩增VP2基因全长序列，获得产物为1758 bp。将其经过胶回收纯化后连接到pMD18-T载体中构建重组质粒，并且测序正确，将其命名为pMD-VP2，作为PCR的阳性模板。

2.2 纳米PCR的建立以及条件优化经过 经各种条件的优化，最终确定纳米PCR体系：2×nano buffer 6 μL，P3/P4(10 μmol/L)0.6 μL(引物终浓度为 1/2 μmol/L)，模板(100 ng/μL)0.8 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O 补至 12 μL；反应条件：94 ℃5 min；94℃ 30 s、48℃ 30 s、72℃ 40 s，30个循环；72℃7 min。普通PCR反应体系中添加4.5 μL 2×GC bufferⅡ和 1.5 μL dNTP，其他试剂和反应条件同纳米PCR。

2.3 敏感性试验 构建的重组质粒测定其浓度为100 ng/μL，换算成拷贝数浓度为 4×1010拷贝 /μL。将重组质粒进行10倍倍比稀释，得到浓度梯度标准品(4 拷贝 /μL～4×1010拷贝 /μL)。纳米 PCR 的最低检出量为4拷贝/μL(图1A)，而普通PCR的最低检出量为4×103拷贝/μL(图1B)，表明纳米PCR比普通PCR敏感1000倍。

图1 纳米PCR(A)和普通PCR(B)的敏感性试验Fig.1 Sensitivity tests of the nano PCR(A)and conventional PCR(B)

2.4 特异性试验 应用纳米PCR对猪的6种主要病毒DNA或者cDNA进行检测，只有以PPV DNA为模板时扩增出472 bp特异性条带，而其他5种病毒核酸检测结果均呈阴性(图2)，表明该纳米PCR具有良好的特异性。

图2 纳米PCR的特异性试验Fig.2 Specificity test of the nano PCR

2.5 纳米PCR与普通PCR对临床样品的检测比较分别应用纳米PCR和普通PCR对3个省份送检的43份临床样品进行检测。结果显示，纳米PCR和普通PCR检测PPV阳性率分别为95%(41/43)和72%(31/43)，表明该纳米PCR比普通PCR更加敏感，适用于低含量PPV临床样品的检测。

3 讨 论

目前，检测PPV的PCR主要包括普通PCR和荧光定量PCR。在临床应用中，普通PCR较为常用，但其敏感性不显著，荧光定量PCR较为精准，但需要精密的仪器并且操作程序复杂。纳米PCR是一种新型的PCR技术，它比普通PCR更加敏感，比荧光定量PCR更加方便快捷。纳米PCR缓冲液中含有粒径为1 nm～100 nm的纳米金属颗粒，当反应时纳米金属颗粒悬浮在液体里形成纳米流体，这种纳米流体相对于普通流体具有更强的导热性，高导热性能够加快温度升高和下降的速度，使反应体系快速达到目标温度，减少在非目标温度的停留时间，增加特异性反应时间，因而最终达到消除非特异性扩增，提高扩增效率和敏感性的目的[6-7]。本研究首次应用纳米PCR技术针对PPV VP2基因进行检测，建立一种快速、敏感、特异的PPV检测方法。本研究建立的纳米PCR比普通PCR敏感1000倍。并且具有良好的特异性。

临床中，在PPV感染初期或者后期病毒载量较低时，应用纳米PCR检测PPV更加高效，适合于基层实验室的使用。本研究中分别应用纳米PCR和普通PCR检测临床样品，结果表明纳米PCR比普通PCR更加敏感。该PPV纳米PCR具有较高的敏感性和特异性，是一种高效的检测手段，可以应用于流行病学调查，同时也为PPV的及时检测、预防和治疗奠定基础。

[1]Martínez C,Dalsgaard K,López de Turiso J A,et al.Production of porcine parvovirus empty capsid with high immunogenic activity[J].Vaccine,1992,10(10):684-690.

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[4]Zheng Lan-lan,Wang Ya-bin,Li Ming-feng,et al.Simultaneous detection of porcine parvovirus and porcine circovirus type 2 by duplex real-time PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green[J].J Virol Methods,2013,187(1):15-19.

[5]Ma Xing-jie,Cui Yu-chao.A nanoparticle-assisted PCR assay to improve the sensitivity for rapid detection and differentiation of wild-type pseudorabies virus and gene-deleted vaccine strains[J].J Virol Methods,2013,193(2):374-378.

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