低氧诱导因子-3α的研究进展

鹿 辉，尹 强，王 荣，谢 华，李文斌，贾正平，张娟红

（兰州军区兰州总医院全军高原损伤防治重点实验室，甘肃兰州 730050）

低氧诱导因子（hypoxia-inducible transcription factor，HIF）最早是由Semenza等［1］于1992年在研究促红细胞生成素基因时发现的。HIF是细胞应对氧气水平降低时的主要调节因子，调控依赖氧气水平相关基因的表达［2］。这些基因主要参与造血、血管生成、离子转运、葡萄糖的利用、细胞外基质的合成、细胞的增殖、生存及凋亡和肿瘤的发生等过程［3－4］。HIF是由一个不稳定的 α亚基（HIF-α）和一个稳定的β亚基（HIF-β）组成的二聚体，具有结合靶基因的低氧反应元件（hypoxia response elements，HREs）的能力，从而发挥调控作用。HIF-α和HIF-β亚基均属于 bHLH-PAS（bHLH，basic helix-loop-helix；PAS，Per-ARNT-Sim；Per，period circadian protein；ARNT，aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein；Sim，single-minded protein）蛋白家族的成员［5］。序列同源性HIF-α亚基在人体中目前认为有3种：HIF-1α（由基因 HIF1A编码）、HIF-2α（由基因 EPAS1编码）和HIF-3α（由基因HIF3A编码HIF-3α的多种剪接变异体）［6］，三者均受氧浓度调节，是调节HIF活性的功能亚单位［8］。。相对于HIF-1α和HIF-2α，对HIF-3α的认识和研究还比较匮乏。HIF-3α存在多种剪切变异体，其功能也不尽相同，调控包括低氧应激在内的多种生理活动。本综述将系统地介绍HIF-3α的结构、表达调控及其在多种生理活动中的调控作用。

1 HIF-3α的结构

HIF-1α和HIF-2α亚基具有相似的结构域，均具有1个N端bHLH结构域，2个PAS结构域，氧气依赖降解结构域（oxygen-dependent degradation domain，ODD）以及 N端和 C端的转录激活结构域（transactivation domain，TAD）组成，N端的TAD结构域的部分序列与ODD重叠［9］。1998年，在老鼠体内首次发现了HIF-α的第3种亚型HIF-3α［10］，在人体内于2001年首次发现HIF-3α［11］。这种新的蛋白与HIF-1α和HIF-2α的bHLH-PAS区域有55%的相似性［10］。与HIF-1α和HIF-2α相似，HIF-3α中也含有1个ODD结构域和1个N-TAD结构域，但没有C-TAD结构域（Fig 1）。

Fig 1 Structural alignment of human HIF-1α，HIF-2α and HIF-3αsubunits

2 人类 HIF-3α（hHIF-3α）的剪接变异体

人类HIF-3α（hHIF-3α）有8种剪接变异体，其结构域见Fig 2，与鼠 HIF-3α（mHIF-3α）相似，人类 HIF-3α基因包含19个内含子，长度大约是43 kb的碱基长度，位于染色体的19q13.2的位置。3个特别的外显子1a、1b和1c很可能含有8种剪接变异体的转录起始位点。外显子2编码bHLH结构域，外显子3-9编码PASa、PASb和PAC（PAS-associated C-terminal domain）结构域，外显子11的3′末端部分、整个的外显子12和外显子13的5′末端部分编码ODD结构域，外显子14a和16编码亮氨酸拉链结构域（leucinezipper，LZIP）［6］。

hHIF-3α1的序列从外显子1c开始，到外显子16终止。hHIF-3α1编码668个氨基酸长度的蛋白质，含有N-TAD结构域，但并不含有C-TAD结构域。有趣的是，与HIF-1α、HIF-2α及其他hHIF-3α的变异体不同的是，hHIF-3α1含有独特的亮氨酸拉链（leucine zipper，LZIP）结构域。LZIP结构具有介导与DNA结合和蛋白质－蛋白质相互作用的功能。hHIF-3α1的另外一个特殊的结构是，在ODD和LZIP结构域的上游具有LXXLL（Leu-Xaa-Xaa-Leu-Leu）基序。LXXLL基序主要在核受体的共因子中发现，是蛋白质相互作用的位点。LZIP和LXXLL结构在HIF-1α和HIF-2α中都不存在，表明hHIF-3α1可能具有结合启动子序列的能力或者结合不被HIF-1α和HIF-2α识别的新蛋白质的能力。hHIF-3α2从外显子1a开始，终止于外显子13a，不包含外显子1b和1c，编码632个氨基酸长度的蛋白质。hHIF-3α2的结构与hHIF-3α1非常相似，但缺少LZIP结构域及其上游的LXXLL基序。hHIF-3α4从外显子1a开始，终止于不完整的内含子8，内含子7没有被剪切掉。编码363个氨基酸长度的蛋白质，只含有 bHLH、PASa和 PASb结构域，缺少 N-TAD、CTAD、ODD和LZIP结构域及LXXLL基序，表明hHIF-3α4可能作为hHIF调控系统的负调控因子。hHIF-3α6从外显子1b开始，缺少外显子3和hHIF3α4相似，含有内含子7并终止于内含子8，hHIF-3α6蛋白只包含 C末端的结构域PASb。hHIF-3α7和 hHIF-3α8结构相似，但 hHIF-3α7缺少LZIP结构域。hHIF-3α9和 hHIF-3α1结构相似，差别仅在于外显子1的不同。值得注意的是hHIF-3α10，其编码序列被内含子1所阻断，因此仅编码7个氨基酸［6－7］。

Fig 2 Multiple spliced variants of the human HIF-3α，Asterisk represents the conserved LXXLL motif

3 HIF-3α的基因表达

急性缺氧（12%O2，2 h）对 HIF-1α、HIF-2α和 HIF-1β的mRNA水平在心、肺、肾和骨骼肌组织中的表达没有明显的影响，但在上述组织中却强烈地诱导HIF-3α的mRNA表达。虽然5个星期的间歇性缺氧训练（intermittent hypoxic training，IHT）可以诱导HIF-3α的mRNA在上述组织的上调表达，但是IHT后的急性缺氧除了在骨骼肌组织可以诱导HIF-3α的mRNA表达上调外，在其他组织中HIF-3α的mRNA都没有被诱导。这说明IHT抑制了急性缺氧在心、肺、肾组织中对 HIF-3α的mRNA的诱导作用［12］。hHIF-3α4被认为是hHIF调控系统的负调控因子。在低氧的刺激下，HIF调控的基因将会被激活从而应对由缺氧造成的细胞损伤，作为HIF系统的负调控因子hHIF-3α4将会是被抑制的。在缺氧4 h的条件下，利用实时定量PCR测定HepG2肝癌细胞和HEK293A人胚肾细胞中内源性的hHIF-3α4的表达水平，与对照组相比分别降低了75%和50%［13］。这说明hHIF-3α4作为HIF系统的负调控因子，在低氧状态下是被抑制的，从而使细胞能够表达氧应激相关基因来应对低氧应激。大鼠mHIF-3α（mHIF-3α）的mRNA水平可在急性缺氧的情况被诱导表达。

令人感到兴奋的是，mHIF-3α除了被低氧诱导外，还可以被其他因素诱导。文献报道［14］，mHIF-3α可以由胰岛素和2-脱氧-D-葡萄糖诱导表达。这提示，mHIF-3α除具有参与低氧应激的功能外，还可能具有其他方面的功能，例如可能在糖代谢的调节方面发挥重要的作用。

4 HIF3α4的负调控作用

HIF-3α4缺少N-TAD、C-TAD和 ODDD结构域，因此被认为是HIF系统的负调控因子。文献报道，HIF-3α4可以与HIF-1α结合，从而降低了 HIF1复合物的水平，对hHIF-1α起负调控的作用。HIF-3α4可以抑制HIF-1α／HIF-β复合物与靶基因HREs序列区的结合，从而抑制了HIF-1α调控的相关基因的表达，起到负调控的作用［13］。利用HEK293A研究发现，HIF-3α4可以与HIF-2α相结合，从而降低HIF2复合物的量，降低HIF-2α的调节作用。研究表明，HIF-3α4与HIF-2α相结合后将明显降低HIF-2α与靶基因HREs序列区的结合，从而抑制了相关基因的表达，起到负调控的作用［15］。HIF-3α4也可以与 HIF-β相结合，可以同时减少体内HIF1和HIF2复合物的量，对HIF-1α和HIF-2α同时起到负调控作用［13，15］。

5 HIF-3α在肺发育过程中的作用

肺的发育是在相对缺氧的条件下进行的，HIF信号通路在肺的发育过程中起了重要的作用。基因HIF3α／NEPAS／IPAS的缺失会导致刚出生小鼠肺重塑功能的缺损［16］。在小鼠肺上皮细胞中表达HIF-3α会导致后期支气管形态的缺陷、肺泡的数量降低和改变上皮细胞类型的分化。实验表明，HIF-3α基因的表达，会使Clara细胞、肺泡Ⅰ型和Ⅱ型细胞的数量有所减少，也使基底细胞处在非经典的空间位置。HIF-3α在小鼠的肺的发育过程中发挥作用，主要的机制是选择性地抑制了HIF-2α基因的表达，并上调Sox2、Rarβ和Foxp2基因的表达［17］。Sox2基因可以直接影响基底细胞的外形［18］，Rarβ基因敲除小鼠表现为肺泡提前分隔，肺泡数量也是正常小鼠的两倍。所以，HIF-3α上调Rarβ基因，从而抑制了小鼠的肺在发育过程中肺泡数量的增加。Foxp2基因具有抑制Ccsp和远端上皮细胞标记（Spc，T1α）的表达作用［19］。这解释了HIF-3α表达后，Clara细胞、肺泡Ⅰ型和Ⅱ型细胞数量减少的原因。

6 HIF-3α在脂肪细胞分化中的作用

HIF-3α除了在肺的发育过程中发挥重要的作用之外，在其他组织的发育过程中也具有重要的作用。HIF-3α在3T3-L1细胞的脂肪细胞分化过程中被诱导表达，说明可能是脂肪细胞分化的促进因子，在脂肪细胞的分化过程中发挥重要的作用。基因芯片分析实验表明，当HIF-3α过量表达时，两个已知的脂肪细胞分化相关基因，aP2和AMPKγ1表达是上调的。脂肪细胞分化相关基因的表达上调，可能是由于HIF-3α的LZIP结构域能够激活脂肪细胞相关基因的表达造成的［20］。

7 HIF-3α在增强耐力中的负调控作用

抑制HIF-3α的mRNA水平将明显提高大鼠的身体耐力。除了IHT可以抑制HIF-3α的mRNA水平外，耐力训练（endurance training，ET）也可以抑制 HIF-3α的 mRNA水平。实验表明大鼠的HIF-3α的mRNA水平在ET联合IHT时只有空白对照组的15%，只进行ET时为对照组的30%。IHT后的ET训练，大鼠表现出最高的身体耐力水平。利用RNA干扰技术，在大鼠的比目鱼肌和腓肠肌中抑制HIF-3α的表达，可以明显的提高大鼠的身体耐力。这说明HIF-3α在大鼠身体耐力增强中具有重要的负调控作用［12］。

8 HIF-3α4在脑膜瘤中的作用

脑膜瘤是血管最丰富的脑瘤之一，有效抑制脑膜瘤的血管生成是一种有效的新疗法。HIF-1α和HIF-2α在肿瘤的血管生成中具有重要的作用，而HIF-3α4被认为是上述两个α亚基的负调控因子。最近的研究表明，在脑膜瘤中HIF-3α4的表达是受到抑制的，这是由于 HIF-3α4的启动子区DNA的甲基化导致的。在富血管脑膜瘤中诱导HIF-3α4高表达，可以有效地抑制脑膜瘤的血管生成、细胞分化和物质代谢，显著地阻滞脑膜瘤的生长。因此，HIF-3α4在脑膜瘤中发挥重要的作用，是潜在的治疗脑膜瘤的潜在分子靶点［21］。

9 总结

HIF是细胞应对氧气水平降低时的主要调节因子，HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α是HIF的3种活性亚基。近年来，对前两种活性亚基，特别是HIF-1α进行了大量的研究工作，对这两个亚基的基因分布及表达调控机制、激活和降解机制以及参与生理活动的机制都有深入的了解，相比前两个亚基而言，对HIF-3α的研究和认识还比较有限。通过最近几年的研究表明，人体的HIF-3α具有6种剪切变异体，每一种的结构都不一样，其发挥的功能也可能不一样。值得注意的是，hHIF-3α4是负调控因子，对HIF信号通路系统起负调控作用，使其与其他亚基相比具有独特性。研究还提示，HIF-3α呈现出功能的多样性，除了参与低氧应激的反应外，还参加了体内的其他生理过程，这也是与HIF-1α和HIF-2α不同的。例如HIF-3α参与组织和器官的分化和发育，以及糖代谢的过程等。由目前的实验结果，我们认识到HIF-3α的功能是复杂的，具有独特性。因此，深入研究HIF-3α的功能及其作用机制是及其必要的，将会为肿瘤和高原疾病的治疗提供新的思路和策略。

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