槲皮素对H2 O2损伤PC12细胞的保护效果与机制

刘红亮，胡 磊，王靖凯，刘 彬，李金菊，邓锦波

（河南大学1.药学院神经生物学研究所、2.护理学院，河南 开封 475004）

细胞内氧化与抗氧化之间的平衡对细胞的生存至关重要，氧化应激水平的提高能够损伤细胞甚至导致细胞死亡，氧化损伤是阿尔采末病、帕金森病等神经退行性疾病以及艾滋病脑病重要的发病机制。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是细胞内氧化应激的重要因素之一，包括超氧离子、羟自由基等［1］。ROS通过氧化损伤多种生物分子包括DNA、膜脂和蛋白质，导致细胞功能障碍，甚至诱导细胞凋亡或坏死［2－3］。SOD、CAT、GSH-PX等抗氧化酶能够清除氧自由基，保护并修复氧化损伤的细胞［4］。

黄酮类化合物具有多种生物活性，包括对神经元发挥类似神经营养因子的保护作用［5－6］。槲皮素（quercetin）是一种广泛存在于中草药和蔬果中的天然黄酮类化合物，研究证明其具有抗癌、抗炎等作用［7］，还可通过调节胞内信号分子保护细胞免受氧化应激损伤［8－9］。本研究利用H2O2诱导类神经细胞系PC12凋亡建立模型，检测槲皮素对PC12细胞的保护作用并初步分析其作用机制，为深入研究其在神经退行性疾病临床治疗上应用的可行性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12细胞）购自中国科学院上海细胞所。槲皮素购自阿拉丁试剂公司（用DMSO配制成浓度为100 mmol·L－1储备液）。高糖DMEM干粉培养基购自美国Gibco公司。胰蛋白酶购自北京鼎国生物科技有限公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。多聚赖氨酸购自美国Sigma公司。H2O2溶液（分析纯）购自无锡市苏强化工有限公司。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定试剂盒、丙二醛（malondialdelyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Hoechst 33342购于美国Sigma公司。TUNEL检测试剂盒购于美国 Promega公司。2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自美国Sigma公司。高内涵活细胞成像系统（high content screening，HCS）购置美国TFS公司。奥林巴斯显微成像系统购于日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 PC12细胞的培养 PC12细胞接种到含有胎牛血清（体积比 10∶1）、100 kU·L－1青霉素和100 mg·L－1链霉素的高糖 DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱培养，常规胰蛋白酶消化传代，备用。

1.2.2 槲皮素对PC12细胞增殖的影响 采用MTT检测槲皮素对PC12细胞增殖的影响，取对数生长期的PC12细胞以5×107个·L－1的细胞浓度接种于96孔培养板中，每孔加入100μl细胞悬液。24 h后，加入100μl的槲皮素溶液，使其终浓度分别为 2 000、1 000、500、250、125、62.5μmol·L－1。继续培养24 h。加入5 g·L－1的 MTT，37℃孵育4 h，再加入150μl DMSO。振荡10 min使结晶甲臜充分溶解后用酶联免疫检测仪570 nm波长下检测OD值。实验重复3次，细胞活力／%＝（实验组平均值／对照组平均值）×100%。

1.2.3 MTT检测槲皮素对PC12细胞的保护 取对数生长期的PC12细胞接种于96孔细胞培养板中，24h后用于实验。实验分为7组：空白对照组、对照组、H2O2损伤组（500μmol·L－1）、槲皮素保护组（500、250、125、62.5μmol·L－1）。首先在保护组中加入槲皮素溶液，使其终浓度达到相应值，2 h后再加入500μmol·L－1H2O2。24 h后，加入 5 g·L－1的MTT，4 h后终止培养，小心地吸弃上清培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10 min后，采用酶联免疫检测仪在570 nm处检测OD值，实验重复3次。细胞活力／%＝（实验组－空白组）／（对照组－空白组）×100%。

1.2.4 LDH法检测槲皮素对PC12细胞的保护细胞在损伤过程，细胞内的LDH会释放到培养基中，而活细胞无此功能，所以培养上清中LDH的含量反映细胞的死亡或损伤程度。各组细胞经相应处理后，吸取细胞培养上清，按照试剂盒说明书操作检测LDH含量。

1.2.5 TUNEL法观察细胞凋亡情况 将对数生长期的PC12细胞接种于放有盖玻片的6孔板中。用PC12细胞为对照，用 H2O2损伤建立模型，以500 μmol·L－1的槲皮素作为保护组，细胞经相应处理过后，按照TUNEL检测试剂盒提供的操作说明书进行凋亡检测。在荧光显微镜下进行显微成像观察并拍照，实验重复3次。

1.2.6 PC12细胞内ROS和MDA含量测定 取对数生长期的PC12细胞以5×107个·L－1的细胞浓度接种于经多聚赖氨酸处理过的96孔细胞培养板中，分设对照组和模型组，用500μmol·L－1的槲皮素处理作为保护组，细胞经上述处理后，吸弃上清培养液，用 0.01 mol·L－1的 PBS洗3次，加入 1 mg·L－1的Hoechst 33342避光染色30 min后，再加入10 μmol·L－1的 DCFH-DA溶液继续染色 30 min。经0.01 mol·L－1的PBS洗3次后，采用高内涵活细胞成像系统（HCS）在激发光为485 nm和发射光为525 nm的条件下检测荧光值。另用6孔板培养PC12细胞，如前所述，分设对照组、模型组和药物保护组，细胞经处理后收集，超声破碎后按照MDA检测试剂盒说明书操作，在530 nm波长下检测OD值并计算其含量，实验重复3次。

1.2.7 PC12细胞内SOD、CAT和GSH-PX含量测定 6孔板培养PC12细胞，分设对照组和模型组，用500μmol·L－1的槲皮素作为保护组。细胞经相应处理后收集，超声细胞破碎后离心，吸取上清100 μl分别在 550、240、412 nm波长下按照 SOD、CAT、GSH-PX检测试剂盒说明书操作测定OD值，并计算其活力，实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，并对MTT、LDH、SOD、CAT和 GSH-PX等检测结果均采用两样本均数比较的t检验，用¯x±s表示。

2 结果

2．1 槲皮素对PC12细胞增殖的影响 Fig 1为槲皮素对 PC12细胞增殖的影响。由图可以看出，PC12细胞在不同浓度的槲皮素作用下，细胞增殖稍有变化，但与对照组相比无统计学意义，由此说明槲皮素对PC12细胞增殖没有影响。

Fig 1 Effect of quercetin on proliferation of PC12 cells（¯x±s，n＝3）

2．2 MTT检测槲皮素对PC12细胞的保护 MTT实验检测槲皮素对PC12的保护效果，结果如Fig 2所示。与对照组比较，模型组的细胞存活率明显降低（P＜0.01），经槲皮素保护后细胞存活率明显增加（P＜0.01，P＜0.05）。

2．3 LDH检测槲皮素对PC12细胞的保护 对照组、模型组和药物保护组培养液中LDH的含量检测结果如Fig 3所示：对照组中的LDH含量较低，而模型组中的LDH含量比较高（P＜0.01）；经槲皮素保护后，LDH含量下降，并随槲皮素浓度的增加而逐渐减少（P＜0.01，P＜0.05），表明槲皮素有效降低H2O2对PC12细胞的氧化损伤，且保护效果与槲皮素浓度呈正相关。

Fig 2 Protective effect of quercetin on PC12 cells viability rate induced by H 2 O2（¯x±s，n＝3）

Fig 3 Protective effect of quercetin on PC12 cells death rate induced by H2 O2（¯x±s，n＝3）

2．4 TUNEL法观察细胞凋亡情况 在显微镜下观察槲皮素保护PC12细胞抗氧化效果的形态学变化，如Fig 4所示。经TUNEL法检测后任选3个视野进行细胞统计，模型组中与对照组相比，经500 μmol·L－1H2O2诱导PC12细胞凋亡情况明显增加（P＜0.01，P＜0.05）；然而与模型组比较，经 500 μmol·L－1槲皮素处理的保护组中凋亡细胞明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。

Fig 4 Protective effect of quercetin on apoptosis induced by H 2O2（tested by TUNEL）（40×，¯x±s，n＝3）

2．5 PC12细胞内ROS和MDA含量的影响 槲皮素保护PC12细胞抵抗H2O2引起的氧化损伤中ROS和MDA的变化，如Tab 1所示：与对照组比较，模型组中的ROS的相对荧光强度（relative fluorescence unit，RFU）和 MDA含量均明显升高（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组比较，保护组中的ROS的相对荧光强度和MDA含量均明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。由此说明，槲皮素能够降低细胞内的ROS和MDA的含量。

Tab 1 Effect of quercetin on ROS and MDA in PC12 cells induced by H 2 O2（¯x±s，n＝3）

2．6 PC12细胞内SOD、CAT和 GSH-PX活力的影响 槲皮素对PC12细胞抗氧化中SOD、CAT和GSH-PX活力的影响如Tab 2所示。从表中可以看出，SOD、CAT和GSH-PX活力明显降低（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组比较，SOD、CAT和 GSH-PX活力明显升高（P＜0.01，P＜0.05）。由此说明，槲皮素能够增加细胞内SOD、CAT和GSH-PX活力。

Tab 2 Effect of quercetin on CAT，SOD and GSH-PX in PC12 cells induced by H 2O2（¯x±s，n＝3）

3 讨论

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，黄酮类化合物在中枢神经系统（CNS）中能够缓解氧化应激引起的氧化损伤，可能对治疗和预防神经退行性病（ND）发挥作用。国内外还少见槲皮素在ND中的应用研究，为此该课题利用槲皮素保护H2O2诱导PC12细胞引起的氧化损伤，初步探讨了槲皮素保护PC12免受氧化损伤的效果与机制。

MTT实验是检测活细胞数量的常用方法，在不同浓度槲皮素保护PC12细胞免受H2O2损伤的实验中，不同浓度的槲皮素明显增加了PC12细胞的存活率，且具有浓度依赖性；当细胞胞膜损伤时，胞内的LDH会释放到培养液中，细胞培养液中LDH含量是检测细胞死亡的一个重要指标。本研究发现H2O2诱导PC12损伤的模型组细胞培养液中LDH水平明显增加，而经不同浓度槲皮素处理之后的保护组细胞培养液中LDH水平明显减少，且存在浓度依赖性。另外，我们用MTT实验还证明，槲皮素在不同浓度下对PC12细胞的存活率都没有统计学意义，说明槲皮素对PC12细胞没有明显的毒性作用或促增殖作用，所以，以上实验结果相互印证，充分说明槲皮素能够有效保护PC12细胞免受H2O2的损伤。细胞死亡有不同形式，凋亡和坏死是细胞死亡的一般方式。TUNEL可以与断裂的DNA片段的3′-OH结合，是检测细胞凋亡的一种有效方法。我们用TUNEL标记分析槲皮素减少PC12细胞死亡的方式，结果证实槲皮素能够降低H2O2诱导的PC12细胞凋亡，说明槲皮素通过减少PC12细胞凋亡产生保护效果。

ROS能够使细胞膜上的脂类氧化，产生MDA，从而造成细胞损伤并引发凋亡，一些药物或中药成分如Va、Vc、Ve、生物黄酮类以及类胡萝卜素等均具有清除自由基活性［10－12］。研究发现，H2O2处理PC12细胞的模型组细胞内ROS的量明显增加，MDA的量也相应上升，用槲皮素保护后，细胞内ROS的量明显降低，MDA的量也明显下降，说明槲皮素能够降低H2O2处理对PC12细胞造成的损伤，这是槲皮素减少H2O2诱导PC12细胞凋亡的重要机制。SOD、CAT和GSH-PX均属于内源性的抗氧化酶，能够直接清除ROS，为了进一步研究槲皮素的抗氧化机制，我们检测了槲皮素对细胞内SOD、CAT和GSH-PX活性的影响，结果说明H2O2处理使PC12细胞胞内SOD、CAT和GSH-PX活性降低，而用槲皮素保护可以明显增加胞内SOD、CAT和GSH-PX活性。

本研究说明槲皮素能够增加H2O2处理的PC12细胞内SOD、CAT和GSH-PX的活性，清除细胞内的ROS，从而减少ROS所诱导PC12细胞的凋亡，实现保护PC12细胞的效果。胞内氧化与抗氧化之间的平衡对细胞的存活和功能起着至关重要的作用，如果两者失衡将会导致ROS大量产生，过量产生的ROS能够诱导胞内相关信号通路发生改变，如基因调节、蛋白氧化损伤和脂质过氧化损伤等［13－14］。氧化应激造成神经细胞损伤是许多神经退行性疾病发病的重要机制，如阿尔采末病（AD）、帕金森病（PD）、癫痫和 X染色体易损综合症等［15－18］。槲皮素是广泛存在于多种中药的天然产物，其对H2O2诱导PC12类神经细胞的保护预示着可能对一些神经退行性疾病有一定疗效，是一种重要的药物前体分子。

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