稳定期COPD患者外周血中Th17和Treg的表达及平衡关系变化

严 青，徐晓玲，夏淮玲，徐 飞，陈 军，刘 辉，石建邦，李 庆

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)已经成为全球第4位死亡原因，且逐年增加，预计到2020年将上升为全球第3位死亡原因和经济负担的第5位［1］，目前普遍认为COPD是一种与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关，发病机制未明确，近年的研究［2］提示COPD的发病可能与自身免疫系统调节紊乱有关。辅助性T细胞17(T help cell 17，Th17)和调节性T淋巴细胞(T regular cell，Treg)均来源于CD4+T细胞，正常情况下促炎的Th17细胞和抑制性的Treg细胞之间保持平衡，维持机体免疫的稳定［3］。该研究通过检测稳定期COPD患者外周血中Th17和Treg的表达及比值变化，探讨Th17与Treg在COPD的发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集安徽医科大学附属省立医院2012年1月～2013年8月住院患者，根据肺功能及吸烟情况分为肺功能正常不吸烟组(A组)，肺功能正常吸烟组(B组)，稳定期COPD组(C组);A组22例，B组22例，C组36例。

纳入标准:A组年龄40～80(46.59±14.40)岁和B组年龄40～80(56.73±11.76)岁，男女不限，肺功能正常，B组吸烟量≥200年支;C组年龄40～80(56.73±11.76)岁，男女不限，根据《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》(2009年修订版)诊断标准，吸入支气管舒张剂后第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)＜70%且半年内无急性发作史纳入C组。排除标准(满足其中任1条):①处于急性发作期或者半年内有急性发作史的COPD患者;②患有风湿免疫系统疾病或者自身免疫缺陷者或过敏性疾病;③1个月内服用糖皮质激素;④ 合并肺部及其他系统感染;⑤疑似或者确诊恶性肿瘤患者。见表1。

表1 各组研究对象一般资料(±s)

表1 各组研究对象一般资料(±s)

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1.2 仪器与试剂 高速水平冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司);CO2培养箱(美国 Thermo scientific公司);流式细胞仪(美国BD公司);淋巴细胞分离液(北京索来宝公司);RPMI 1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司);抗人CD4-FITC单克隆抗体、抗人IL-17-PE单克隆抗体、抗人CD25-PE单克隆抗体、抗人Foxp3-PECy5单克隆抗体、固定破膜剂及莫能霉素(Monensin)(美国 eBioscience公司);佛波酯(PMA)及离子霉素(ionomycin)(美国Enzo Life Science公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本收集和 PBMC的制备 抽取受试者清晨空腹静脉血6 ml置2支肝素抗凝管中，PBS与血液等比稀释，平铺于淋巴分离液之上，离心后，提取白膜层至流式管中，加入PBS，离心，弃上清液。分别取100 μl至A管和B管将细胞浓度调整为2×106个/ml。

1.3.2 流式细胞术检测Th17和Treg ① Th17将A管中加入RMPI 1640培养液、PMA(5 ng/ml)、ionomycin(500 ng/ml)、Monensin(2 μm/ml)置 CO2培养箱培养4 h，加入PBS，离心，弃上清液，加入CD4-FITC，4℃避光孵育30 min，洗涤，弃上清液后加入破膜剂，避光孵育1 h，洗涤，弃上清液，加入IL-17-PE，避光孵育30 min，洗涤，弃上清液，上机检测。② Treg将B管中加入CD4-FITC、CD25-PE，避光孵育30 min，洗涤，弃上清液，加入破膜剂，避光孵育1 h，洗涤，弃上清液，加入 Foxp3-PECy5，避光孵育1 h，洗涤，弃上清液，上机检测。分析软件为 Flow Jo7.6，应用散点图，设门，分析 Th17和 Treg占CD4+T细胞的百分比。

图1 在外周血中Th17细胞表达流式散点图

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料用±s表示，多个样本两两比较采用单因素方差分析。两变量关联性分析，吸烟量与Th17、Treg及 Th17/Treg相关性采用 Spearman相关，Th17、Treg、Th17/Treg 与 FEV1/预计值(%)及FEV1/FVC(%)的相关性分析采用Pearson相关。

2 结果

2.1 3组外周血中Th17细胞的表达率 3组外周血中Th17细胞表达流式散点图分析，见图1。C组外周血Th17细胞的表达率(%)为(4.52±1.54)，明显高于 B组(3.13±1.05)以及 A组(1.16±0.50)，差异有统计学意义(P＜0.01);B组Th17细胞外周血中的表达高于A组(P＜0.01)。3组之间的差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

2.2 3组外周血中Treg细胞表达率 C组外周血中Treg细胞的表达率(%)是(5.10±1.36)，高于A组(2.10±0.87)(P＜0.01)和B组(4.15±0.96)(P＜0.01);B组高于A组(P＜0.01);3组间的差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。3组外周血中Treg细胞表达流式散点图分析见图2。

2.3 3组之间Th17/Treg的比值差异 Th17/Treg

比值C组(0.98±0.50)明显高于 A组(0.59±0.27)和B组(0.78±0.32)，A组和C组的差异具有统计学意义(P＜0.01)，但A组与B组及B组与C组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 各组的Th17、Treg表达率以及Th17/Treg比值的比较(±s)

表2 各组的Th17、Treg表达率以及Th17/Treg比值的比较(±s)

与A组比较:☆☆P＜0.01;与B组比较:▲▲P＜0.01

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图2 3组外周血中Treg细胞表达流式散点图A:荧光扣除对照;B:肺功能正常不吸烟组;C:肺功能正常吸烟组;D:稳定期COPD组

2.4 相关性分析 ①3组数据汇总分析外周血中Th17细胞和Treg细胞的表达与吸烟量呈正相关(r=0.50，r=0.65，P ＜0.01);Th17/Treg 的比值与吸烟量无明显相关性(r=0.13，P ＞0.05)。② 3组数据分析Th17细胞与FEV1/预计值(%)(r=－0.38，P＜0.01)和FEV1/FVC(%)(r= －0.34，P＜0.01)呈负相关;Treg细胞表达率与FEV1/预计值(%)(r=－0.65，P＜0.01)以及 FEV1/FVC(%)(r=－0.54，P ＜0.01)呈负相关;Th17/Treg比值与FEV1/预计值(%)(r= －0.36，P ＜0.01)和 FEV1/FVC(%)(r= －0.34，P ＜0.01)呈负相关。

3 讨论

已有研究［4］显示仅在吸烟所致的COPD的患者的炎性特点是以CD8+Tc1淋巴细胞增加为主要表现。COPD小气道壁上中性粒细胞、巨噬细胞、CD4细胞、CD8细胞、B细胞、淋巴滤泡增多，并且随着COPD病情的严重程度加重而增加，这提示COPD存在着固有免疫和获得性免疫的异常T淋巴细胞影响COPD的炎症反应［5］。

Th17是一个新的Th亚群，主要通过分泌IL-17发挥促炎功能，是Th17的主要效应分子。Vargas-Rojas et al［6］研究发现COPD患者外周血中Th17细胞数高于吸烟者和健康对照者，并与FEV1/预计值(%)和FEV1/FVC(%)呈反比，并随着气流受限的程度加重，Th17的细胞数也随之增加，与本研究结果相一致。Harrison et al［7］在动物试验中发现长期暴露于香烟烟雾后肺组织内的IL-17含量明显升高，小鼠肺上皮细胞大量分泌IL-17能够引起类似于COPD的肺部感染。这提示Th17在吸烟引起的肺气肿的免疫应答中起着重要作用。

Tregs是一群具有抑制功能的T细胞亚群，其抑制效应性T细胞的增殖、激活以及B细胞产生免疫球蛋白等。本研究结果显示与肺功能正常不吸烟组和肺功能正常吸烟组比较，稳定期COPD组的外周血中Treg百分比增加，并与FEV1/预计值(%)和FEV1/FVC(%)呈反比，与吸烟量呈正比，且肺功能正常吸烟组中的Treg的表达率高于不吸烟组。本实验与Smyth et al［8］研究结果相一致:健康吸烟组和COPD组的肺泡灌洗液中的Treg表达是上调的，且Foxp3 T细胞数与吸烟量呈正相关。在COPD患者和肺功能正常的吸烟组的外周血中的Treg表达率也是增加的［6］。由此推测，烟草成分直接刺激或持续性炎症反应的产物有关。COPD是一种慢性气道炎症，在COPD的稳定期，Treg处于高表达状态可能与其持续发挥抗炎作用有关。

Th17和Treg细胞均来源于初始T细胞，促炎的Th17细胞和抗炎的Treg细胞在分化和功能上相互制约，正常生理情况下二者保持平衡才能保持机体的稳态，一旦这种平衡被打破就会导致免疫调节失常，引起疾病的发生，如感染、肿瘤及自身免疫性疾病。本实验结果显示COPD组Th17/Treg的比值明显高于肺功能正常不吸烟组，并与吸烟量呈正相关，与肺功能呈负相关。虽然COPD患者外周血中的Th17和Treg均是上调的，但是这种上调更倾向于Th17细胞，Th17的增加幅度高于Treg，这表明Th17的促炎比Treg的抗炎功能强，Treg上调不足，来不及有效的抑制炎症，最终导致Th17和Treg细胞之间的平衡被打破，使得气道内的炎症反应持续存在，这种Th17/Treg失衡在COPD的动物模型中也得出相同的结论［9］。因此，这进一步为COPD的发病存在自身免疫应答的假说提供了依据，也为未来COPD新的治疗方案的发现引导一个新的方向。

［1］Rabe K F，Hurd S，Anzueto A，et al.Global strategy for the diag-nosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease:GOLD executive summary［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，176(6):532 －55.

［2］Agusti A，MacNee W，Donaldson K，et al.Hypothesis:does COPD have an autoimmune component?［J］.Thorax，2003，58(10):832－4.

［3］Heo Y J，Joo Y B，Oh H J，et al.IL-10 suppresses Th17 cells and promotes regulatory T cells in the CD4+T cell population of rheumatoid arthritis patients［J］.Immunol Lett，2010，127(2):150 －6.

［4］Barnes P J，Shapiro S D，Pauwels R A.Chronic obstructive pulmonary disease:molecular and cellular mechanisms［J］.Eur Resprit J，2003，22(4):627 －88.

［5］Hogg J C，Chu F，Utokaparch S，et al.The nature of small-airway obstruction in chronic obstruction pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2004，350(26):2645 －53.

［6］Vargas-Rojas M I，Ramírez-Venegas A，Limón-Camacho L，et al.Increase of Th17 cells in peripheral blood of patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.Respir Med，2011，105(11):1648－54.

［7］Harrison O J，Foley J，Bolognese B J，et al.Airway infiltration of CD4+CCR6+Th17 type cells associated with chronic cigarette smoke induced airspace enlargement［J］.Immunol Lett，2008，121(1):13－21.

［8］Smyth L J，Starkey C，Vestbo J，et al.CD4-regulatory cells in COPD patients［J］.Chest，2007，132(1):156 － 63.

［9］Wang H，Peng W，Weng Y，et al.Imbalance of Th17/Treg cells in mice with chronic cigarette smoke exposure［J］.Int Immunopharmacol，2012，14(4):504 －12.