DHA促NGF诱导的PC12细胞分化与BMPs通路关系的研究

周 心，石宝燕，吴科锋，高 翔，黄俊炎，黄 韧，李文德，

（1.广东医学院药理学教研室，2.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江 524023；3.广东省实验动物监测所，广东 广州 510260）

Omega-3脂肪酸是一组多元不饱和脂肪酸的家族，主要成员包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。其中DHA在中枢神经系统特异性浓集，是神经元细胞膜的主要组成部分［1］，而近年的研究发现，DHA对神经分化、神经细胞形态改变以及学习记忆等都有明显的促进作用［2-3］。此外，大量的动物实验及临床实验也证明，DHA的早期膳食供给能提高婴儿后认知能力发展［4］和幼鼠记忆相关的学习能力［5］。相反的，在发育期间缺乏DHA，降低大脑中的DHA含量，可诱发实验动物的认知缺陷［6］。而在年龄相关性神经系统退行性疾病，如阿尔采末病（Alzheimer’s disease，AD）中，患者表现出认知功能障碍，其海马中DHA浓度水平较正常人有明显下降，而补充DHA可有效改善这一症状［7］，这说明发育脑中高丰度的DHA参与神经发育调节，而且其含量与认知功能有着密切的联系。尽管DHA已被广泛应用于保健医疗等领域，但其作用的分子机制至今尚不明确。而在已发现的众多调控机制中，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是研究较为深入的明星分子。它是转化生长因子（transforming growth factor-β）超家族的成员，其受/配体信号通路在神经元分化与神经元形态发育中发挥着重要作用［8］。DHA与BMPs相似的功能提示我们，两者可能是通过相同的信号通路起作用的。而PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞克隆化的细胞株，可在神经生长因子NGF诱导下增殖和分化，是目前广泛用来研究神经细胞功能、分化和凋亡的一种细胞培养模型。因此，本实验拟通过PC12细胞观察DHA对NGF诱导PC12细胞分化的作用及其对BMP信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM（Gibco公司）；NGF、DHA和多聚赖氨酸（Sigma公司）；胎牛血清、马血清（Hyclone公司）；兔抗多克隆抗体MAP-2一抗、兔抗βactin、HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）、HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG（H＋L）（Signalway Antibody公司）；DAPI（ROCHE公司）；兔抗来源的多克隆抗体BMP7一抗（Abcam公司）；羊抗来源的多克隆抗体BMPR-Ⅱ一抗、兔抗来源的多克隆抗体p-Smad 1/5/8和鼠抗来源的多克隆抗体BMP4一抗（Santa Cruz公司）、Affinity Purified Antibody cy3 Labeled Goat anti-Rabbit IgG（Kpl公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物有限公司）；总蛋白提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 PC12细胞培养 PC12细胞（购自上海细胞生物学研究所细胞库）置于DMEM培养液中，内含10%马血清、5%胎牛血清、青霉素1×105U·L-1、链霉素1×105U·L-1，于37℃、5%CO2条件下培养，待细胞长至80%时，按1∶3分瓶传代，约3 d传代1次，取对数生长期细胞分组进行实验。

1.3 实验分组 PC12细胞用含10%马血清、5%胎牛血清的DMEM培养基以1×108个·L-1接种于预先多聚赖氨酸处理的12孔板中，24 h后换用含1%胎牛血清和1%马血清的DMEM培养基，实验分别设置对照组（100μg·L-1NGF）、DHA组（100μg·L-1NGF＋10μmol·L-1DHA）。

1.4 MAP-2与DAPI免疫荧光染色 吸弃培养基，PBS洗2次；预冷的4%多聚甲醛室温固定30 min；PBS洗2次，每次 3 min；0.1%Triton-100作用5 min；PBS洗2次，每次3 min；封闭用正常山羊血清工作液室温封闭20 min；吸出封闭液，勿洗；加入1∶150稀释的MAP-2，4℃过夜；PBS洗3次，每次3 min；加入二抗稀释液稀释的Affinity Purified Antibody cy3 Labeled Goat anti-Rabbit IgG二抗，室温避光孵育50 min；PBS洗3次，每次3 min；加入用蒸馏水稀释至终浓度为2 mg·L-1的DAPI，室温避光孵育15 min；PBS洗3次，每次3 min；倒置荧光相差显微镜观察并拍照。随机选取50个细胞，显微镜测微尺测量其突起长度和突起数目。

1.5 气相色谱法检测PC12细胞DHA的含量 将PC12细胞按照5×108·L-1接种于预先多聚赖氨酸处理含10%马血清、5%胎牛血清DMEM的培养皿，培养24 h后，换用含1%胎牛血清和1%马血清的DMEM培养基，分别在3、6、9 d时取出细胞，吸掉培养基，用含1%BSA的PBS洗2次，冰上刮取细胞于离心管中，4 000 r·min-1离心5 min；倒掉上清，加入1.5 ml正己烷，吹打混匀，用吸管转移至干净的螺旋帽玻璃瓶中；加入1.5 ml 4℃储存的三氟化硼于螺旋帽玻璃瓶中，往瓶中吹氮气约25 s，盖紧瓶盖；于恒温干浴型加热器中，100℃恒温加热1 h；加热结束，置于室温冷却后每瓶中加入1 ml双蒸水，涡旋振荡1 min，3 000 r·min-1离心 5 min；用吸管将瓶中上层液转移至干净的气相色谱瓶；在通风厨中，用氮气吹干气相色谱瓶中的液体；每个气相色谱瓶加入100μl正己烷，涡旋振荡2 min；把气相色谱瓶中的正己烷转移至内存管，再放回气相色谱瓶，盖紧盖子，封口胶封口，-20℃避光保存，切勿倒置。

1.6 W estern blot检测 将PC12细胞按照5×108·L-1接种于预先多聚赖氨酸处理含10%马血清、5%胎牛血清DMEM的培养皿，培养24 h后，换用含1%胎牛血清和1%马血清的DMEM培养基，分别在3、6、9 d时取出细胞，吸掉培养基，用含1%BSA的PBS洗两次，将培养皿中的PC12细胞用细胞刮冰上收集到相应离心管中，2 000 r·min-1离心10 min，PBS漂洗1次，使用总蛋白提取试剂盒提取蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白浓度。每孔上样50μg蛋白，12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗 BMP4（1∶50）、BMP7（2.5 mg·L-1）、BMPR-Ⅱ（1∶50）、p-Smad 1/5/8（1∶50）、β-actin（1∶500），二抗（1∶1 000），化学发光法显示结果，压片曝光，显影定影后扫描。利用Image-Pro plus 6.0分析软件对实验结果进行分析，以目的条带与内参β-actin的平均吸光度比值表示相对表达水平，进行半定量分析。

1.7 统计学处理 每个实验至少重复3次，每次实验至少有3个重复值。实验结果数据均采用¯x±s表示，并采用GraphPad统计软件进行单因素方差（One-Way ANOVA）分析。

Tab 1 Effect of DHA on neurite development of PC12 cells（±s）

Tab 1 Effect of DHA on neurite development of PC12 cells（±s）

**P＜0.01 vs control group.

Group Neurite-length/μm Number of neurite 3 d 6 d 9 d Control 7.4±0.8 17.8±5.3 22.4±3.8 0.6±0.5 1.3 d 6 d 9 d 4±1.0 1.8±0.7 DHA 18.6±3.9** 34.3±10.9** 39.7±7.9** 1.8±0.7** 2.8±0.9** 3.3±1.1**

2 结果

2.1 MAP-2免疫荧光法观察DHA对NGF诱导的PC12细胞突起的影响 如Fig 1和Tab 1所示，对照组细胞在培养3 d时，只有少数细胞长出细短的突起；而DHA与NGF共同作用3 d时，细胞突起长度与对照组相比增长。DHA与NGF共同作用6 d时，DHA组与对照组的细胞相比，DHA组细胞的突起增长、突起数目增多；同样的，DHA与NGF共同作用9 d，与对照组相比，DHA组细胞的体积增大，突起长度明显增长，突起数目明显增多。

2.2 气相色谱检测PC12细胞中的DHA含量 气相色谱检测结果如Tab 2所示，在培养3 d时，对照组细胞的DHA含量过低，不在检测限之内，而DHA组细胞的DHA含量为2.48%；培养6 d时，对照组细胞的DHA含量仍低，不在检测限之内，而DHA组细胞的DHA含量为5.68%；培养9 d时，对照组细胞DHA含量为1.3%，DHA组为6.98%。

Fig 1 Promotion effect of DHA on NGF-induced neurite outgrow th in PC12 cells（200×）

Tab 2 DHA content of DHA group and control group analysed by gas chromatography（¯±s）

Tab 2 DHA content of DHA group and control group analysed by gas chromatography（¯±s）

“--”Notwithin the limits of detection.**P＜0.01 vs control group.

G r o u p D H A c o n t e n t/%3 d 6 d 9 d C o n t r o l -- -- 1.3 0±0.2 5 D H A 2.4 8±0.2 8**5.6 8±0.7 2**6.9 8±0.5 4**

2.3 W estern blot结果 用Western blot的方法检测 PC12细胞BMP4、BMP7、BMPR-Ⅱ和 p-Smad 1/5/8蛋白的表达。结果如Fig 2所示，与对照组相比，DHA组细胞的BMP7、BMPR-Ⅱ蛋白表达明显增加，以作用6 d的细胞表达量较多；DHA组细胞BMP4和p-Smad 1/5/8表达量高于对照组，且6 d和9 d的细胞表达量较多。

3 讨论

DHA促进大脑发育及改善认知功能的观点在学界已得到普遍认同。近年的研究发现，DHA主要影响脑内神经元的生长状况，且补充DHA可促进成年哺乳动物DG区神经元的分化，增加神经元树突棘的密度和活性神经元的数目，增强神经元突触可塑性［9-10］。此外，DHA还可促进胚胎干细胞、神经元及拟神经细胞如PC12细胞等的增殖和分化能力，并能明显增加各类细胞突起的长度和分支数目［11-13］。从本实验MAP-2免疫细胞化学染色的结果，我们发现诱导9 d的PC12细胞对照组与DHA组相比差异明显，DHA组细胞体积、突起长度和数目都明显比对照组增大和增多，证明了在NGF存在的情况下，DHA可以明显促进PC12细胞突起的生长及提高PC12细胞的分化水平。我们进一步用气相色谱法探讨PC12细胞在给予DHA处理后，细胞DHA含量的变化，气相色谱的结果表明，对照组PC12细胞随着NGF诱导时间的增加，细胞的突起长度不断增长、突起数目不断增多，且细胞中DHA的含量也不断增多，但与DHA组相比，DHA组细胞的DHA含量更高。以上结果进一步表明了补充DHA有助于增强NGF诱导PC12细胞的分化。在中枢神经系统发育过程中，神经元分化和随后的形态发生是其中最为关键的环节。骨形态发生蛋白是转化生长因子超家族的成员，最早被发现是与骨骼系统的发育形成过程密切相关，而越来越多的研究表明，不同亚型的骨形态发生蛋白在神经系统的不同区域呈持续性表达，一系列的实验研究表明，不同亚型的BMPs配体蛋白在神经系统发育过程中发挥重要作用，如BMP2、BMP4和BMP7在顶盖区域有特异的高表达，若采用基因手段干预其表达，则会引起许多中枢神经结构的表达缺失，造成先天畸形［14］。Lein等［15］早在上世纪 90年代就发现 BMP7对交感神经元树突发育有强大的促进作用。也有研究［16］指出BMP7表达的缺失可导致脑膜和海马发育缺陷。进一步的研究也发现［17］，另一配体蛋白BMP2具有类似神经营养因子的作用，可诱导PC12细胞系神经分化，促进神经元形态发生，并在体外培养环境中发挥促进GABA能神经元存活和分化的作用［18］。但目前尚无明确的研究证实，DHA促进神经元或拟神经细胞的分化及生长与BMPs配体蛋白的表达有关。

本实验发现，与对照组相比，添加10μmol·L-1DHA可不同程度的上调了BMP4、BMP7、BMPRⅡ和P-smad 1/5/8蛋白的表达，这说明补充DHA可能促进BMPs配体蛋白的表达，促进BMPs信号通路的活化。以上结果表明，增加PC12细胞的DHA摄取，能促进NGF诱导的PC12细胞分化过程，其机制可能与上调BMPs中 BMP4、BMP7蛋白的表达，激活更多的BMPRII受体并与之结合，使I型受体磷酸化后，招募效应分子Smad 1/5/8，使Smad 1/5/8磷酸化水平升高。大量的磷酸化 Smad 1/5/8与Smad4结合并转运至核内，在其他转录因子的协同作用下，形成转录复合物结合至靶基因的调控区域，从而调控靶基因的表达以发挥生物学效应。

Fig 2 Expression of BMP4，BMP7，BMPR-Ⅱand p-Smad 1/5/8 protein upregulated by DHA¯x±s，n＝3）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

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