清热养心颗粒中绿原酸在不同血浆中的蛋白结合率测定

吴 磊，陆 超，戴国梁，孙冰婷，丁 康，居文政

（1.南京中医药大学附属医院，2.南京中医药大学，3.南京中医药大学附属医院临床药理科，江苏南京 210029）

清热养心颗粒是江苏省中医院制剂，具有补气养阴，清热解毒之功，临床主要用于病毒性心肌炎等的治疗。现代研究表明，该制剂中绿原酸有明显的抗炎、抗氧化、抗凝血等多种活性［1］，且是指标性成分［2］。

药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一，影响药物在体内的分布、排泄和代谢速率，对药物的半衰期也有影响，与药物的药理药效作用密切相关。因此，它是新药临床评价中不可缺少的指标。研究表明［3］药物间可能存在竞争性蛋白结合，而绿原酸在清热养心颗粒中的血浆蛋白结合率尚未见报道。本文选取绿原酸为检测指标，采用平衡透析法研究其在大鼠、人、比格犬血浆中的药物蛋白结合率，为临床合理用药提供血浆蛋白结合率参数。

1 材料与方法

1.1 材料 清热养心颗粒（江苏省中医院医院制剂，规格：10 g/袋，批号201307001，绿原酸含量：0.47%）。对照品绿原酸（批号 110753-200413）和咖啡酸（批号 110885-200102）均购于中国药品生物制品检定研究院。

正常人空白血浆（江苏省中医院提供），大鼠、比格犬空白血浆（南京中医药大学实验动物中心提供）。大鼠许可证号：SCXK（沪）-2008-0016，比格犬许可证号：SCXK（沪）-2007-0004。

1.2 仪器 Agilent1100（包括四元泵、自动进样器、紫外检测器），Micro-17R冷冻离心机；Labconco离心浓缩仪；Direct-Q5超纯水机；透析袋（14000 D，美国联合碳化）。

1.3 绿原酸血浆蛋白结合率试验［4］将透析袋一端折叠用线结扎，将空白血浆1 ml加入透析袋，透析袋内留一小空气泡，将透析袋另一端扎紧，使其悬浮于盛有30 m l透析外液的带盖玻璃瓶中，透析外液中清热养心颗粒质量浓度分别为2、6、18 mg·L-1，调整透析袋的高度，使其内外液面保持同一水平，并避免透析袋贴壁，将该样品4℃放置至药物扩散平衡。透析结束后，用10%高氯酸溶液检查透析外液是否有蛋白漏出，有漏出者该样品作废。

1.4 液相色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱温：40℃，流速：1 ml·min-1，检测波长：327 nm，进样量：20μl，流动相：甲醇（B）-乙腈（C）-0.1%磷酸（D）＝10∶5∶85。

1.5 溶液的配制

1.5.1 空白透析液 精密称取磷酸氢二钾14.11 g、磷酸二氢钾2.59 g、氯化钠1.99 g于1 L量瓶中，加去离子水溶解并稀释至刻度，得pH 7.4磷酸缓冲液。

1.5.2 绿原酸系列溶液 精密称定绿原酸对照品10.50 mg，加甲醇定溶至10 ml的容量瓶中，超声20 min，得浓度1 050 mg·L-1对照品储备液。取500μl贮备液用甲醇稀释成质量浓度分别为 525.0、262.5、131.25、65.63、32.81、16.41、8.20 mg·L-1的对照系列溶液。

1.6 样品预处理 精密吸取血浆样品透析内液样品100 μl，加50μl 1 mol·L-1盐酸，加内标原儿茶醛（52.5 mg·L-1）10μl，再加 800μl乙酸乙酯，震荡3 min，离心，取上清液吹干，100μl 50%甲醇复溶，震荡，离心，取上清液750μl作为供试品。

1.7 方法学考察 按生物样品分析的相关要求，考察专属性、线性范围、定量限、提取回收率、方法回收率、精密度。

1.8 透析膜吸附性和透析平衡时间考察 参照文献［5］方法，考察透析膜对绿原酸的物理吸附作用及绿原酸的透析平衡时间。

2 结果

2.1 方法学考察 在上述条件下进行检测，绿原酸和内标的保留时间分别为7.0 min和5.6 min左右，峰形对称，达基线分离，空白血浆中无内源性物质的干扰，专属性好。在透析外液及透析内液（不同血浆）中，绿原酸在0.82～52.5 mg·L-1浓度范围内的线性关系良好，定量限为0.82 mg·L-1。配制绿原酸质量浓度为2、6、18 mg·L-1的血浆质控样品，按“样品预处理”项下方法操作，进行提取回收率、方法回收率、精密度试验；用空白透析液配制绿原酸质量浓度为2、6、18 mg·L-1的透析外液质控样品，直接进样分析，进行精密度试验。结果表明，不同血浆的透析内液中绿原酸日内精密度RSD均小于6%，日间精密度RSD均小于8%；透析外液中绿原酸的日内精密度RSD均小于5%，日间精密度RSD均小于7%，回收率结果见Tab 1，以上结果均符合生物样品的检测要求。

Tab 1 Extraction recovery and method recovery of chlorogenic acid in differentmedium（±s，n＝5）

Tab 1 Extraction recovery and method recovery of chlorogenic acid in differentmedium（±s，n＝5）

Analyte 66-1 Rats 84.3±5.5 85.6±5.2 83.6±3.2 95.8±1.6 97.Extraction recovery/%2 mg·L-1mg·L-1 18 mg·L-1 Method recovery/%2 mg·L-1mg·L-1 18 mg·L 6±2.1 96.6±1.9 Beagle dogs 86.1±4.2 89.1±3.2 90±5.1 96.6±1.4 98.1±2.3 97.8±1.1 Humans 88.5±7.2 91.0±6.1 92.4±6.3 103.3±4.599.9±3.8 102.6±2.8

2.2 透析膜吸附性和透析平衡时间 绿原酸的透析平衡时间为24 h，透析平衡后2、6、18 mg·L〛的绿原酸透析膜吸附率（透析膜吸附的药物量占总药物量的百分比）（n＝3）分别为（2.35±1.12）%、（3.61±1.05）%、（3.51±1.42）%，表明存在微量吸附作用，对测定结果无明显影响。

2.3 血浆蛋白结合率的测定［6］清热养心颗粒中绿原酸的蛋白结合率结果见Tab 2，运用SPSS11.5软件进行分析，分别比较大鼠、比格犬和人在不同浓度药液中的血浆蛋白结合率，且结果表明血浆蛋白结合率人＞大鼠＞比格犬。

Tab 2 Protein binding rates of three species of plasma with chlorogenic acid（±s，n＝5）

Tab 2 Protein binding rates of three species of plasma with chlorogenic acid（±s，n＝5）

Analyte Protein binding rates/%2 mg·L-1 6 mg·L-1 8 mg·L-1 Rats 45.4±2.7 47.7±3.0 45.8±1 Beagle dogs 40.3±2.1 42.6±1.8 42.9±2.3 Humans 54.3±2.0 50.2±2.5 52.1±3.1

3 讨论

任静等［7］研究绿原酸单体在不同血浆中蛋白结合率的结果表明，绿原酸在大鼠、比格犬、人的血浆蛋白结合率分别为44.2%、33.2%、43.5%，该结果与本实验中的蛋白结合率无明显差异，说明清热养心颗粒中的其他成分对绿原酸的蛋白结合率不存在影响。

血浆中与药物相结合的血浆蛋白主要是白蛋白、α-酸性糖蛋白和脂蛋白，其中白蛋白含量最高（正常值达35～55 g·L-1），且白蛋白主要与有机酸类药物结合，绿原酸属于酚酸类化合物，因此推测绿原酸在大鼠、比格犬和人血浆可能与白蛋白结合较紧密。

实验结果看出，绿原酸在3种血浆中的蛋白结合率不同，不具有浓度依赖性，而且存在中等强度的蛋白结合率，在大鼠、比格犬和人血浆中的平均血浆蛋白结合率分别表现为人＞大鼠＞比格犬，说明绿原酸的蛋白结合率存在种属差异性。

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