利用RNA干扰技术探讨STAT3对宫颈癌C33a细胞增殖的影响

王 森 陈荏槐 康海鲜 姚运红 胡新荣 朱 伟*

（广东医学院肿瘤研究所，广东 东莞 523808）

利用RNA干扰技术探讨STAT3对宫颈癌C33a细胞增殖的影响

王 森 陈荏槐 康海鲜 姚运红 胡新荣 朱 伟*

（广东医学院肿瘤研究所，广东 东莞 523808）

目的为了探讨信号转导与转录活化因子3（STAT3）对宫颈癌细胞的作用，我们利用RNAi干扰其表达，检测其对C33a细胞增殖的影响。方法实验分组为对照组（即正常C33a细胞组）及干扰组（即RNA干扰STAT3组）。利用新型阳离子脂质体转染试剂Hilymax导入STAT3 RNA干扰序列，而后检测STAT3的表达，并利用CCK-8法检测C33a的细胞增殖水平改变。结果与对照组相比，干扰组STAT3 mRNA下降约75%，显示成功干扰STAT3的基因表达。与对照组相比，在1、2、3 d，干扰组细胞增殖水平较对照组抑制了约19.1%，31.2%，32.0%。结论本研究成功干扰C33a细胞STAT3的表达，且STAT3沉默可进一步抑制C33a细胞增殖。

STAT3；C33a；RNA干扰

信号传导与转录活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族是一组可以被不同的细胞因子受体激活的蛋白。STAT3是其最为重要的家族成员之一，已有研究表明，STAT3对肿瘤的发生发展具有重要的促进作用。为了探讨STAT3对宫颈癌的作用，我们利用RNAi干扰其表达，检测其对C33a细胞增殖的影响，以期为将来以STAT3为靶点进行肿瘤的防治研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌C33a细胞为广东医学院肿瘤研究所保存。Hilymax转染试剂购自上海同仁化学。DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司。STAT3的RNA干扰序列由广州吉玛生物技术有限公司合成。实验中使用的CCK-8试剂盒购买于上海生工生物技术服务有限公司。

1.2 方法

实验分组为对照组（即正常C33a细胞组）及干扰组（即RNA干扰STAT3组）。利用新型阳离子脂质体转染试剂Hilymax导入STAT3 RNA干扰序列，而后于48 h检测STAT3的RNA表达，并利用CCK-8法检测C33a的细胞增殖水平改变。

转染步骤：Hilymax/siSTAT3=3/1的比例转染C33a细胞（STAT3 RNA干扰序列为：5'-AAC AUC UGC CUA GAU CGG CUA dTdT-3'，3'-dTdT GUA GAC GGA UCU AGC CGA U-5'）。Trizol法提取总RNA，并将其反转录为cDNA进行荧光定量PCR反应。STAT3的引物序列为：上游引物：TGTGCGTATGGGAACACCTA；下游引物：AGAAGGTCGTCTCCCCCTTA；Realtime PCR反应体系如下：首先加入10 μL 2× SYBR Green Master （ROX），而后加入10 μM引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，最后以ddH2O补足20 μL。

C33a细胞增殖检验方法：将收获的转染后的各组6孔板细胞以每孔5000细胞的浓度铺板于96孔板。于1、2、3 d时分别加入CCK8每孔10 μL，1～2 h后采用酶标仪检测450 nm处吸光度值。细胞抑制率计算公式为：（对照组实际吸光度值/干扰组实际吸光度值-1）×100%。

2 结 果

采用Hilymax转染试剂将STAT3的RNA干扰序列转染宫颈癌C33a细胞，后进行PCR检测。结果显示，与对照组相比，在RNA水平，干扰组STAT3 mRNA下降约75%，显示成功干扰STAT3的基因表达（图1A）。在细胞的增殖影响方面，CCK-8检测结果显示，与对照组相比，在1、2、3 d，干扰组细胞增殖水平较对照组分别抑制了约19.1%，31.2%（P＜0.05），32.0%（P＜0.05）（图1B）。

图1 RNA干扰STAT3的表达及其对C33a细胞增殖的影响

3 讨 论

宫颈癌是女性生命健康的最重要杀手之一，全世界宫颈癌病例每年有多于27万患者死亡[1-3]。宫颈癌发生发展过程中牵涉到一系列的信号分子与通路，其中，信号传导与转录激活因子（STAT）蛋白家族是最重要的一个环节。STAT蛋白含有SH2和SH3结构域，它们可与特定的肽段结合。STAT磷酸化后进入胞核内促进靶基因的转录。目前已经克隆了7种STAT基因：STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6。其中，STAT3可能是宫颈癌的促癌因子。研究表明，宫颈癌组织中磷酸化STAT3表达增高，这提示了STAT3的促癌功能[4,5]。此外，STAT3也能够促进很多明确的促癌因子如VEGF，MMP-9等的转录表达，进而发挥促瘤功能[6,7]。因此，本实验初步选择STAT3作为靶向目标，也为将来的深入研究做一铺垫。

RNAi技术利用短链RNA（siRNA）直接结合靶mRNA后导致其降解，从而敲减基因的表达，研究已证明RNAi技术是观察基因功能的有效方法。我们利用RNA干扰技术成功干扰了C33a细胞中STAT3的表达，其mRNA表达下降约75%。STAT3被敲减后，干扰组C33a细胞的增殖受到抑制。总之，本研究成功干扰C33a细胞STAT3的表达，且STAT3沉默可进一步抑制C33a细胞增殖。

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R73

B

1671-8194（2014）22-0081-02

国家自然科学基金（81302244）；广东省自然科学基金博士启动项目（S2012040006311，S2012040006383）；广东省卫生厅医学科研基金（编号：B2013293）；广东医学院科研基金项目（B2011004，B2011012）

*通讯作者