注射用埃索美拉唑钠无菌及细菌内毒素检查方法学的研究

刘志武武会芝王 霞李健和

（1 岳阳市一人民医院，湖南 岳阳 410004；2 中南大学湘雅二医院药学部，湖南 长沙 410011；3 中南大学药学院，湖南 长沙 410013）

注射用埃索美拉唑钠无菌及细菌内毒素检查方法学的研究

刘志武1武会芝2,3王 霞2,3李健和2

（1 岳阳市一人民医院，湖南 岳阳 410004；2 中南大学湘雅二医院药学部，湖南 长沙 410011；3 中南大学药学院，湖南 长沙 410013）

目的建立注射用埃索美拉唑钠无菌和细菌内毒素的检查法。方法采用中国药典2010年版二部附录无菌和细菌内毒素检查法。结果样品管无菌生长，6株阳性对照菌生长良好。注射用埃索美拉唑钠稀释至浓度为1.0 mg/mL时对细菌内毒素检查法无干扰作用。结论采用薄膜过滤法进行注射用埃索美拉唑钠的无菌检查，使用细菌内毒素检查法检查注射用埃索美拉唑钠中的细菌内毒素是可行的。

注射用埃索美拉唑钠；无菌；薄膜过滤法；细菌内毒素；鲎试剂

注射用埃索美拉唑钠是一种质子泵抑制剂，通过抑制胃壁细胞的H+-K+-ATP酶来降低胃酸分泌，防止胃酸的形成，用于患胃食管反流疾病而无法吞食埃索美拉唑缓释胶囊患者的短期治疗[1]。鉴于近年来该制剂销售势态良好，其临床应用疗效肯定，无明显毒副作用，故立项研究开发规格为40 mg的注射用埃索美拉唑钠。目前尚未见注射用埃索美拉唑钠无菌及细菌内毒素检查方法研究的报道，本品属注射类制剂，为了确保临床用药安全，故参考相关文献[2-5]，并按照中国药典2010年版二部无菌和细菌内毒素检查法的要求[6-7]，对本品进行了无菌和细菌内毒素检查方法学的研究。现将其研究结果报道如下。

1 试验材料

仪器：HTY-2000型智能集菌仪及一次性全封闭集菌器（杭州泰林医疗器械厂生产）；SW-CJ-2D净化工作台（苏州净化有限公司）；FA2004A电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）；PYX-DHS细菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；MJ-160B霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗器械厂）；201-1-S型电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；XW-8/0A涡轮混合器（上海琪特分析仪器有限公司），ET-96内毒素凝胶法测定仪（天津市天大天发科技有限公司），规格为250 μL和1000 μL的微量移液器（大龙兴创实验仪器有限公司）。

菌种与培养基：铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]；金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；生孢梭菌 [CMCC（B）64941]；黑曲霉[CMCC（F）98003]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]。营养肉汤培养基（批号：121022）；营养琼脂培养基（批号：130516）；改良马丁琼脂培养基（批号：120113）；硫乙醇酸盐流体培养基（批号：120409）；改良马丁培养基（批号：120410）。以上菌种和培养基均由中国药品生物制品检定所提供，菌种代数均为第3代。

鲎试剂（TAL）：湛江安度斯生物有限公司，规格：0.1 mL，批号：1310230，灵敏度：0.25 Eu/mL；湛江安度斯生物有限公司，规格：0.1 mL，批号：1310301，灵敏度：0.125 Eu/mL；湛江博康海洋生物有限公司，规格：0.1 mL，批号：1306070，灵敏度：0.25 Eu/mL；湛江博康海洋生物有限公司，规格：0.1 mL，批号：1306060，灵敏度：0.125 Eu/mL。

细菌内毒素国家标准品：中国食品药品检定研究院，规格：1 mL，批号：150601-201377，效价：70 Eu/支。

细菌内毒素检测用水（BET）：中国食品药品检定研究院，规格：5 mL，批号：2011-8。

供试品：注射用埃索美拉唑钠由中南大学湘雅二医院药学部研制生产，批号：20130901、20130902、20130903，规格：40 mg。

2 无菌检查方法学

2.1 菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，于30～35 ℃培养18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28 ℃培养24～48 h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数＜100CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，于23～28 ℃培养5～7 d，加入5 mL含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数＜100 CFU的孢子悬液。

2.2 方法验证：按中国药典2010年版二部附录Ⅺ H，采用薄膜过滤法进行验证。取供试品20支，加0.9%氯化钠溶液适量使溶解；采用一次性二联滤器，先将滤器用少量稀释剂润湿，使稀释剂顺利流出，再将供试品溶液注入滤器，滤干，每筒用100 mL、200 mL 0.1%无菌蛋白胨水溶液（含＜100 CFU试验菌）冲洗，滤干，将硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基100 mL注入二联滤器。置规定温度培养5 d逐日观察结果。

2.3 试验结果：试验结果见表1。表1中的结果表明：按规定量取供试品照薄膜过滤法处理，当每膜用0.1%蛋白胨水溶液冲洗达100 mL时，可消除本品对试验所用细菌、霉菌和酵母菌生长的影响。

表1 无菌检查方法验证结果

2.4 结论：经上述方法验证试验，确定本品无菌检查方法如下：取本品，加0.9%氯化钠溶液适量使溶解，经薄膜过滤法处理，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗（每膜100 mL），以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查，应符合规定。

3 细菌内毒素检查方法学

3.1 细菌内毒素限值（L）的确定：根据公式：L=K/M，其中K为按规定的给药途经，人用每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，静脉注射K=5 EU/（kg·h），M为人用每千克体质量每小时接受注射用埃索美拉唑钠的最大剂量。参考本品临床的用法用量可知，推荐每日1次静脉注射或静脉滴注本品20～40 mg。反流性食管炎患者应使用40 mg，每天1次；对于反流疾病的症状治疗应使用20 mg，每天1次。注射用药：配制溶液的静脉注射时间应至少在3 min以上；滴注用药：配制溶液的静脉滴注时间应在30 min内。滴注液的制备是通过将本品1支溶解至0.9%氯化钠溶液100 mL，供静脉滴注使用。M=40 mg/（60 kg·1 h）≈0.67mg/（kg·h），K= K1+K2，其中K1为人用每千克体质量每小时最大可接受本品的内毒素剂量，K2为人用每千克体质量每小时最大可接受0.9%氯化钠溶液100 mL的内毒素剂量，K2＝100×0.5/（60 kg·1 h）≈0.83 EU/（kg·h），因此，K1＝（K-K2）=5-0.83=4.17 EU/（kg·h）。L＝K1/M＝4.17/0.67≈6.2 EU/mg。国家食品药品监督管理局进口药品注册标准JX20080211中规定注射用埃索美拉唑钠的细菌内毒素检查为：每1 mg埃索美拉唑钠中含内毒素量应不得过2.0 EU，严于理论限值，为了便于操作和从严控制产品质量，确保临床用药安全，本品细菌内毒素限值（L）定为2.0 EU/mg。

3.2 有效稀释浓度（MVC）的计算：根据公式MVC=λ/L，其中L为供试品的细菌内毒素限值，λ为鲎试剂标示灵敏度。目前市售鲎试剂灵敏度λ通常在0.5～0.03 EU/mL之间，则本品的对应有效稀释浓度为：C0.5=0.5/2.0=0.25 mg/mL；C0.03=0.03/2.0=0.015 mg/mL。

3.3 鲎试剂灵敏度的复核：按中国药典2010年版二部附录“细菌内毒素检查法”规定的方法进行TAL灵敏度复核，将细菌内毒素工作标准品用BET溶解，在涡轮混合器上混合15 min后分别制成不同浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在涡轮混合器上混合30S。取复溶后的每支0.1mL不同浓度的内毒素标准溶液，每个内毒素浓度平行4管，另取2管加入0.1mLBET作为阴性对照。2批不同灵敏度的TAL分别进行试验，测定结果见表2。

表2 TAL灵敏度复核试验结果

表1结果表明：上述2批鲎试剂经用细菌内毒素国家标准品复核灵敏度，λc在2.0～0.5λ之间，均可用于细菌内毒素检查。

3.4 干扰实验预实验：将本品用细菌内毒素检查用水分别稀释成浓度为1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、0.015 mg/mL的埃索美拉唑钠溶液，将此系列浓度溶液记为NPC。同时按上述试验液浓度配制并加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，记此系列浓度为PPC。取灵敏度分别为0.125、0.25 EU/ mL的两个不同厂家的鲎试剂，分别与上述PPC和NPC进行反应，每一浓度重复两管，并设阳性和阴性对照。

由以上预干扰试验结果可以初步了解：对两个厂家鲎试剂，本品三批样品细菌内毒素试验结果均在浓度为1.0 mg/mL以下时无干扰。

3.5 干扰实验：为了最终确认是否存在干扰因素的影响，进行以下正式干扰试验。取本品用细菌内毒素检查用水分别进行稀释，使其最终干扰试验浓度为1.0 mg/mL，按中国药典2010年二部附录中的“细菌内毒素检查供试品干扰项”进行实验。

正式干扰试验结果表明：Es在2.0～0.5λ之间（包括2.0λ和0.5λ）及Et在2.0～0.5Es之间时，确认本品在1.0 mg/mL浓度下无干扰影响。

3.6 样品的细菌内毒素检查：按中国药典2010年版二部附录中的“细菌内毒素检查法”，使用两批不同厂家的鲎试剂分别对三批注射用埃索美拉唑钠进行细菌内毒素检查，并同时设立样品的自身阳性对照管。

3.7 结论：经上述方法验证试验，确定本品细菌内毒素检查方法如下：依法检查（中国药典2010年版二部附录Ⅺ E），每毫克埃索美拉唑钠中细菌内毒素含量应＜2.0 EU。

4 讨 论

4.1 无菌检查法所用冲洗液为0.9%灭菌氯化钠溶液，该液主要有调节等渗作用，而无菌检查中还需考虑在大量冲洗后细菌易受损及营养支持问题，因此选用含营养成分的0.1%蛋白胨水溶液即可满足要求。此外，拉唑类药物在蛋白胨溶液中易形成混悬液影响过滤，故本品应先用0.9%无菌氯化钠溶液溶解后过滤，再用0.1%蛋白胨水溶液冲洗。本品需用100 mL0.1%蛋白胨水溶液冲洗后才能消除抑菌成分，应少量多次冲洗，每张滤膜每次冲洗量不能过多，总冲洗量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

4.2 无菌检查目的，既要保证中国药典2010年版二部规定的所有阳性对照菌正常生长，又要准确无误检查样品染菌情况。经实验建立的方法验证试验其既能保证6株阳性对照菌正常生长，又能准确无误检查本品染菌情况故可作为注射用埃索美拉唑钠的无菌检查法。

4.3 样品预干扰试验的目的是评价样品浓度对鲎试剂与内毒素凝集反应的干扰程度及干扰性质，以便初步筛选出对检查无干扰的样品浓度范围。试验结果表明，样品浓度在0.015～1.0 mg/mL时，对细菌内毒素检查法均无干扰作用。采用1.0 mg/mL供试品溶液进行干扰确证试验，Es在2.0～0.5λ之间（包括2.0λ和0.5λ）及Et在2.0～0.5 Es之间（包括2.0 Es和0.5 Es），说明1.0 mg/mL供试品溶液不干扰鲎试验。采用两个厂家的鳖试剂与供试品溶液（1.0 mg/mL）进行细菌内毒素检查，供试品细菌内毒素限量均在2.0 EU/mg限值以下，供试品细菌内毒素限量均合格，故本品采用限值2.0 EU/mg进行细菌内毒素检查法是可行的。

[1] 于志卿,王美玲,王洪欣.注射用埃索美拉唑钠[J].齐鲁药事,2005,24(12):758.

[2] 方玲芬,徐洪.注射用奥美拉唑钠无菌检查法方法学研究[J].中国药品标准,2006,7(4):64-66.

[3] 朱梅红,吉同琴.注射用兰索拉唑无菌检查方法学研究[J].西北药学杂志 2008,23(6):381-383.

[4] 潘正兴,宋勤.注射用奥美拉唑钠细菌内毒素检查法[J].药物分析杂志,2008,28(2):275-277.

[5] 戴艳,吉同琴.注射用兰索拉唑细菌内毒素检查法[J].中国药师,2009,12(1):122-123.

[6] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2010年版.中国医药科技出版社,2010:附录.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2010年版.中国医药科技出版社,2010:附录88-91.

Studies on Bacterial Endotoxin Test and Sterility Test for Esomeprazole Sodium for Injection

LIU Zhi-wu1, WU Hui-zhi2,3, WANG Xia2,3, LI Jian-he2
(1 The First People's Hospital of Yueyang, Yueyang 414000, China;2 Department of Pharmacy The Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China;3 Pharmacy of Central South University,Changsha 410013, China)

ObjectiveTo establish bacterial endotoxin test and sterility test for esomeprazole sodium for injection.MethodsAccording to the method of determination of bacterial endotoxin and sterility approved by Chinese Pharmacopoeia 2010 edition.ResultsAll of six strains positive control tubes reveal growth of micro-organism and the substance control gives no evidence of growth.The interference on the determination of bacterial endotoxin can be excluded when esomeprazole sodium for injection was diluted 1.0mg/mL.ConclusionIt is feasible to detect the bacterial endotoxin and microbial contamination of esomeprazole sodium for injection by the method of determination of bacterial endotoxin and membrane filtration,respectively.

Esomeprazole sodium for injection; Sterility test; Membrane filtration method; Bacterial endotoxin test; Tachypleus amebocyte lysate

R975

B

1671-8194（2014）22-0010-03