SSR分子标记技术在西瓜品种纯度快速鉴定中的应用研究

2014-05-18田雅栏吴明生

种子科技 2014年7期

关键词：标记技术纯度西瓜

牛茜，田雅栏，吴明生

（1.北京市种子管理站，北京 100088；2.北京市农学院植物科学技术学院，北京 102206）

SSR分子标记技术在西瓜品种纯度快速鉴定中的应用研究

牛茜1，田雅栏2，吴明生1

（1.北京市种子管理站，北京 100088；2.北京市农学院植物科学技术学院，北京 102206）

根据杂交种带型双亲互补的原则，从10对西瓜SSR引物中筛选出适合北京市主栽西瓜品种纯度鉴定引物，其中品种京欣1号和京欣3号可鉴定的引物最多，均达到6对；京秀和航兴天秀1号可鉴定引物最少，只有两对。结合西瓜种仁DNA快速提取方法，利用筛选的引物对已知纯度样品进行鉴定，结果显示SSR标记能准确鉴定样品中混杂的亲本种子，可用于西瓜杂交品种纯度快速鉴定。

西瓜；品种纯度；SSR；快速鉴定

西瓜是北京市主要农作物，也是京郊农业大力发展的特色经济作物之一，在北京常年种植面积达1万hm2，因此保障西瓜种子质量对京郊农业发展具有重要意义。种子纯度作为衡量种子质量的4项重要指标之一，由于缺乏有效快速的室内检测方法，在质量监督检验中很少开展西瓜种子纯度鉴定，这也间接影响着西瓜种子质量的提高。

近年来，随着分子标记技术的快速发展，利用分子标记鉴定农作物种子纯度成为可能，目前在玉米[1]、水稻[2]等一些作物上取得很好效果，这也为西瓜种子纯度快速鉴定提供了新的途径。本文针对北京市目前主栽的7个西瓜品种，利用SSR分子标记技术，筛选了可以进行纯度鉴定的引物，同时利用筛选的引物对实际样品进行了检测，实现了纯度室内快速鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

京欣1号、京欣2号、京欣3号、京欣无籽1号、京秀、暑宝和航兴天秀1号7个西瓜品种及其亲本材料，均取自北京市审定农作物标准样品库。

1.2 生化试剂

植物新型基因组DNA提取试剂盒、Taq酶、dNTPs、DNA Marker购自北京天根生化科技有限公司，PCR所用的10对SSR引物，由上海英骏生物技术有限公司合成，其余试剂由北京化学试剂公司提供。

1.3 DNA提取

采用热碱法快速提取。种子去壳后，将种仁放进深孔板中，向每个孔加入150 μL NaOH溶液（0.1 M），盖膜后将深孔板放在桌面上水平来回摇晃10下，把深孔板放在沸水浴中加热5 min后加入150 mL Tris-HCl溶液(10 mM、pH2.0)，水平来回摇晃10下，上清液即可作为DNA模板用于扩增。

1.4 SSR-PCR

PCR 扩增体系包括 MgCl22.5 mol/L、dNTPs 0.15 mol/L、引物0.25 μmol/L、Taq聚合酶0.1U、1×Taq Buffer、基因组DNA 1μL，补水至总体积为10 μL。扩增反应在Eppendorf PCR仪 (Mastercycler nexus X1)上进行。PCR扩增程序：94℃5 min；94℃30 s，60℃35 s，72℃45 s，38个循环；最后72℃延伸5 min，4℃保存。PCR扩增产物采用4.5%变性聚丙烯酰胺或3.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果分析

2.1 引物筛选

采用10对SSR引物（序列信息见表1）对7个西瓜杂交品种组合进行筛选，依据杂交种带型双亲互补的原则（如图1），7个西瓜品种都筛选出适合其纯度鉴定的引物（见表2），其中京欣1号和京欣3号的可鉴定引物最多，达到6对；其次是暑宝，有5对引物可以鉴定；京秀和航兴天秀1号可鉴定引物最少，只有两对。

10对引物中，不同的引物鉴定品种纯度的能力差异较大，其中引物BVWS01843和BVWS00209能鉴定的品种最多，可以用于5个品种的鉴定，而引物BVWS00048和BVWS00333可鉴定的品种最少，均为1个。

图1 引物“BVWS00297”筛选的结果

表1 10对SSR引物序列信息

表2 西瓜品种纯度鉴定引物表

2.2 纯度鉴定

在京欣1号40粒杂交种样品中掺入4粒父本和4粒母本，获得已知纯度的待测样品。采用热碱法提取西瓜单粒种子DNA，用互补带片段大小差异较大的引物BVWS01843对该样品进行检测，PCR产物经3.0%琼脂糖凝胶电泳显示该引物，能准确检测出掺入的4粒父本和4粒母本种子（如图2），检出率达到100%，与实际相符，说明筛选的引物可有效鉴别西瓜杂交种与亲本，适合西瓜品种纯度快速检测。