双酶法制备奶味香精的研究

王孟辉，陈 静，关志涵，钱文涛，王 斌，胡鹏丽，李洪亮，母智深

(内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司，内蒙古呼和浩特011500)

奶味香精，也称作乳香香精、乳香香味剂，是一种具有奶香香气的食品添加剂。与奶制品的品种相对应，奶味香精分为鲜奶、炼奶、奶油、黄油干酪、酸奶等香型［1－2］。它是食品工业中应用最为广泛的香精之一，从膨化食品到糖果炒货食品，从冷饮到饮料，从乳制品到非乳品都有其用武之地。目前，国内张之涤［3］，王璋等［4］，李雁群［5］等人利用不同来源的酶制剂制得的增味物质对乳香香精进行修饰，从而大大提高天然乳品香精的品质，武彦文等［6］脂肪酶对不同类型的奶油、奶酪和牛奶等进行酶解，得到了奶香浓郁，赋香效果明显的奶味香精。国外Toelstede S等［7］人利用乳蛋白酶解产物中的增味物质配制成各种天然牛奶或奶酪香精，可以显著增强香精中乳滋味的浓厚感与持久感。Balcao V M等［8］，King R D等人［9］对奶油酶解增香的研究主要集中在特异性脂肪酶对酶解底物水解程度的控制以及脂肪酶的固定化两个方面。Kirimura J 等［10］，Arnold R G 等人［11］利用不同来源的脂肪酶对乳脂肪进行适当酶解，通过控制酶解程度以得到具有不同奶香特征的产物，从而达到增香的目的。中国是世界上人口最多的国家，每年对奶香精的消耗量十分巨大，随着人们生活水平的提高，消费者对奶香精品质的要求将越来越高，在满足口感的同时，天然、安全、健康、多样化的产品将成为消费者需求的方向。而市场的发展趋势是淘汰无核心技术的简单重复开发产品，因此，开发天然、绿色、健康的产品具有广阔的发展前景和巨大的市场空间。本研究采用双酶结合可控酶解技术对稀奶油进行酶解，先采用蛋白酶将稀奶油中的蛋白质水解，产生小分子肽及多肽类的呈味物质，使产品味道自然柔和，然后再加入脂肪酶对脂肪进行酶解，进而释放出更多的呈味物质，促使酶解产物强度增加、风味丰富、香味十足，为工业化生产奶味香精提供一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

稀奶油 蒙牛乳业;脂肪酶CR 美国万力;复合蛋白酶ProTamEx1.17L 诺维信;磷酸氢二钠(纯度97%)、磷酸二氢钠(纯度98%)吴江市杰达化工有限公司。

FLUKO乳化器 上海弗鲁克流体机械制造公司;酸度计 上海精密科学仪器有限公司;JB－50D型增力电力搅拌机 上海南汇慧明仪器厂;DK－S22电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;AB204－N电子天平 梅特勒－托利多仪器有限公司;恒温摇床 上海精宏实验设备有限公司;Agilent 7890 A/5975C气相色谱质谱联用仪 安捷伦科技有限公司;S433D型全自动氨基酸分析仪 北京捷盛依科科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复合蛋白酶酶解方法

1.2.1.1 酶添加量 称取适量稀奶油调节体系的pH为6.0，分别加入 0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 和0.05%比例的酶(加酶量为酶与底物的百分比)，控制温度45℃，转速150r/min，进行水解反应，3.5h后测定稀奶油中蛋白质的水解度。

1.2.1.2 酶解温度 称取适量稀奶油调节体系的pH为6.0，加酶量为 0.04%，温度分别 30、35、40、45、50℃，转速150r/min，进行水解反应，3.5h后测定稀奶油中蛋白质的水解度。

1.2.1.3 酶解时间 称取适量稀奶油调节体系的pH为6.0，加酶量为0.04%，温度40℃，酶解时间分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5h，转速 150r/min，进行水解反应，完毕后测定稀奶油中蛋白质的水解度。

1.2.1.4 正交实验因素水平表 在单因素实验的基础上，采用L9(34)正交实验，研究加酶量、酶解温度和时间三因素对稀奶油水解度的影响，因素水平见表1。

表1 L9(34)正交实验水平因素表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

1.2.2 脂肪酶CR水解稀奶油酶解方法

1.2.2.1 酶添加量 称取适量稀奶油调节体系的pH为7.0，分别加入 0.03%、0.04%、0.05%、0.06% 和0.07%比例的酶(加酶量为酶与底物的百分比)，控制温度40℃，转速150r/min，进行酶解反应，14h后测定酶解稀奶油的酸价。

1.2.2.2 酶解温度 称取适量稀奶油调节体系的pH为7.0，加酶量为 0.06%，温度分别 30、35、40、45、50℃，转速150r/min，进行水解反应，14h后测定酶解稀奶油的酸价。

1.2.2.3 酶解时间 称取适量稀奶油调节体系的pH为7.0，加酶量为0.06%，温度45℃，酶解时间分别为12、14、16、18、20h，转速 150r/min，进行水解反应，完毕后测定酶解稀奶油的酸价。

1.2.2.4 正交实验因素水平表 在单因素实验的基础上，采用L9(34)正交实验，研究加酶量、酶解温度和酶解时间三因素对稀奶油酸价的影响，因素水平见表2。

表2 L9(34)正交实验水平因素表Table 2 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

1.2.3 水解度测定 氨基态氮含量的测定:甲醛法［14－16］测定，总氮含量的测定:凯氏定氮法，参照 GB/T5009.5。

1.2.4 酸价的测定 酸价测定采用酸碱中和法［17－18］。

注:V－滴定消耗的氢氧化钾溶液体积mL;N－氢氧化钾溶液当量浓度mol/L;56.1－氢氧化钾的毫克当量;W－试样重量g。

1.2.5 感官评定方法 将稀奶油酶解物在玻璃奶瓶中摇匀，待分层现象完全消失、颗粒上下浮游较为均匀时，用胶头滴管吸取少量样液于烧杯中，用水温约30℃的纯净水稀释成浓度为0.2%的溶液，搅拌均匀，用以进行感官评定，总分为10分(其中气味、滋味各占5分)，气味和滋味所得分值相加即为感官分值，各评香师所得分值总和与评香师人数比值即为最终感官分值，本文参与感官评价人员12人，人员组成见表 3，评分标准见表 4［19］。

表3 感官评价人员组成表Table 3 Staff composition of sensory evaluation

1.2.6 GC－MS分析法 采用Agilent 7890 A/5975C气相色谱质谱联用仪 EMV:1500V;离子源温度:230℃;MASS range:29～500amu;柱温:57～260℃(4℃/min、最高温时保持10min);柱流过:1mL/min(He)［12，20］。

表4 稀奶油酶解物感官评分标准Table 4 Sensory evaluation standard of cream hydrolysate

1.2.7 氨基酸分析 采用S433D型全自动氨基酸分析仪 色谱柱:AccQ·Tag;氨基酸分析柱(3.9×150mm，4μm);流速:1mL/min;柱温:37℃;进样量:10μL;检测波长:248nm［13］。

2 结果与分析

2.1 复合蛋白酶水解稀奶油的工艺条件

2.1.1 加酶量对蛋白水解度的影响 从图1中可以看出，随着加酶量的增加，水解度在不断增大，水解度的增加幅度减小，当加酶量在0.04%时，水解度达到最大，随着加酶量增加水解度在下降，可能酶在酶解过程中水解度达到最大值时，本身不进行作用，而自身又是蛋白质导致水解度降低，故选择加酶量为0.04%。

图1 不同加酶量对稀奶油水解度的影响Fig.1 Effect of proteinase dosage on degree of hydrolysis of cream

2.1.2 温度对蛋白水解度的影响 从图2可以看出，随着酶解温度的增加，水解度不断增大，酶解温度升高到40℃后，水解度不升反而降低，酶促水解反应在40℃时，反应速度快，低于此温度时，酶活力低，水解度低;当温度高时，由于酶逐渐产生变性作用而减弱甚至丧失其催化活力，导致反应速度降低。本实验中，酶解最适温度为40℃。

2.1.3 酶解时间对蛋白水解度的影响 如图3随着反应时间的增加，水解度在增大，到4.5h以后，水解度增加的幅度在减小，说明在4.5h之内，水解率随反应时间增加而升高;4.5h之后，底物量不断减少，酶活力下降，反应速度增加幅度降低，导致水解率反而降低，故选择酶解时间4.5h。

图2 酶解温度对稀奶油水解度的影响Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on degree of hydrolysis of cream

图3 酶解时间对稀奶油水解度的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis of cream

2.1.4 正交实验结果分析 在酶水解过程中，各因素之间存在极为复杂的交叉作用和互补作用，从而影响着酶解程度。为优化水解条件，在单因素实验基础上，采用了L9(34)正交实验，研究酶用量、温度、反应时间三因素对水解度的影响(固定反应体系的pH6.0，由酶本身的性质决定)。由极差分析知:酶用量是此反应的关键，温度次之，作用时间影响最小。最优水解条件为:加酶量为0.04%，温度45℃，酶解时间3.5h，蛋白质的水解度达到17.3%。

表5 L9(34)正交实验结果Table 5 Results of L9(34)orthogonal test

2.2 脂肪酶CR水解稀奶油的工艺条件

2.2.1 加酶量对脂肪酶酶解反应的影响 从图4中可以看出，随着加酶量的增加，酸价在不断增大，开始曲线的斜率由小变大，随着加酶量的增加，曲线斜率在减小，当加酶量大于0.06%时，酸价增加的幅度减小但仍具有增加的趋势，从能耗和生产周期等综合因素考虑，加酶量0.06%较为合适。

图4 加酶量对酶解稀奶油酸价的影响Fig.4 Effect of proteinase dosage on acid value of cream

2.2.2 温度对脂肪酶酶解反应的影响 从图5可以看出，随着酶解温度的增加，开始酸价在不断增大，当酶促水解反应在45℃时，反应速度最快，低于此温度时，酶活力低，解脂率低;当温度高时，可能是酶在作用的同时自身逐渐变性导致酶活减弱甚至丧失其催化活力，使其反应速度降低。结合实际情况选择酶解温度为45℃。

图5 温度对酶解稀奶油酸价的影响Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on acid value of cream

2.2.3 时间对脂肪酶酶解反应的影响 如图6所示，随反应时间的增加，酸价在增大，到16h以后，酸价增加的幅度在减小，说明在16h之内，解脂率随反应时间增加而增大;16h之后，随着底物浓度不断的减少，酶活力下降，酸价增长趋势逐渐减缓，选择16h较为合适。

2.2.4 正交实验结果分析 通过表6的极差分析可知，其他因素不变的情况下，对水解度影响最大的因素为酶解温度(R=9.867)，加酶量次之(R=9.666)、而酶解时间(R=6.866)，其大小顺序为:B(酶解温度)＞A(加酶量)＞C(酶解时间)，根据正交实验结果得出，最优工艺组合为 A2B2C3，即加酶量为0.06%，温度45℃，酶解时间18h，酶解稀奶油的酸价为55.4。

2.3 稀奶油酶解物挥发性成分分析

图6 时间对酶解稀奶油酸价的影响Fig.6 Effect of enzymolysis time on acid value of cream

采用GC－MS方法对稀奶油原液及双酶结合分步酶解方法制得的稀奶油酶解物进行挥发性香气成分的分析，结果如表7所示。

表6 L9(34)正交实验结果Table 6 Results of L9(34)orthogonal test

从GC－MS的分析报告数据表7来看，酶解后的稀奶油与原料相比，含量较高的组分仍是脂肪酸、酯、醛、醇、酮和硫化物等物质，种类差别不大，这些物质是重要的挥发性香气组成部分。但短链及中链脂肪酸，如癸酸、辛酸、丁酸等，含量大大增加，对挥发香气的加强有很大作用。说明酶解过程中主要进行了脂肪酸甘油三酯的降解，在脂肪酶的作用下，水解出了大量游离脂肪酸，使稀奶油风味中的脂肪酸特征被释放出来。由于稀奶油风味的形成是一个各种风味物质协同产生的复杂过程，在进行酶解以及风味浓缩生产香精的过程中，要做到稀奶油风味的原汁原味维持，是一个需要全面而细致的控制和研究。

2.4 稀奶油酶解物氨基酸成分分析

采用氨基酸自动分析仪对稀奶油原液及其酶解物进行氨基酸成分分析，结果如表8所示。

由表8的氨基酸分析表明，酶解液氨基酸总量达23.80mg/g，相比酶解前增长了约十二倍。其中必需氨基酸种类齐全，含量占总氨基酸含量的59.13%。与原料相比，除天门冬氨酸外，其它氨基酸含量都大幅升高。

表7 稀奶油原料及酶解物香气成分比较Table 7 Comparison of compound aroma of cream materials and enzymatic components

续表

表8 稀奶油原料及酶解物氨基酸成分比较Table 8 Comparison of amino acid of cream materials and enzymatic components

增幅最大的氨基酸是组氨酸，增长了62倍，其他增加幅度较高的依序有异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，这几种氨基酸也在酶解物中具有较高的含量。

3 结论

从GC－MS的分析数据来看，酶解后的稀奶油与原料相比，短链及中链脂肪酸，如癸酸、辛酸、丁酸等，含量大大增加，对挥发香气的加强有很大作用。甲基酮类和内酯类物质相比之下含量较少，从而突显了酶解稀奶油特殊的风味。通过氨基酸分析表明，酶解液氨基酸总量达23.80mg/g，相比酶解前增长了约12倍。其中必需氨基酸种类齐全，含量占总氨基酸含量的59.13%。与原料相比，除天门冬氨酸外，其它氨基酸含量都大幅升高。氨基酸含量的变化也间接地说明蛋白酶在酶解过程中除产生氨基酸外，同时也产生了大量的没有彻底变成氨基酸的多肽类物质，而多肽类物质中含有的风味肽能使奶味香精呈现出更加饱满自然的香气，经感官分析，本研究制备的奶味香精具有浓度高、香味醇等特点。

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