不同发酵原料对普洱茶抗氧化活性的影响

刘 春，刘 建，龚加顺

(云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650201)

普洱茶属黑茶类，原产于我国云南西双版纳地区，是以云南特有的大叶茶为原料，经杀青、揉捻、日晒等工序制成晒青毛茶，再经特殊后发酵工艺并经蒸压制成的各种规格的成品茶，因早期集散地在云南普洱县而得名［1］。普洱茶在发酵过程中，发生转化、酶促及非酶促氧化、降解、缩合等化学反应，形成了非常复杂的物质基础，除含有多酚类、儿茶素类、黄酮类等主要活性成分外，还含有多种生物碱、氨基酸和有机酸类化合物等成分［2］。普洱茶具有降血脂、减肥［3－4］、抗癌［5］、降压、防治糖尿病［6］、提高免疫力、抗氧化［7］、生津止渴、醒酒解毒等多种功效［8］。大量研究表明，普洱茶的多种药理活性均与其抗氧化活性相关［1］。

本研究以晒青绿茶、半发酵红茶和全发酵红茶为原料，经固态发酵制备普洱茶，再以三种普洱茶的水提法提取物作为研究对象，进行还原力、清除DPPH自由基能力、抑制脂质体过氧化活性、清除羟基自由基能力的测定从而评价其抗氧活性。可以为选择和加工制作具有高抗氧化活性的普洱茶的发酵原料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶样 以晒青绿茶、半发酵红茶和全发酵红茶为原料发酵普洱茶，昌宁茶厂提供;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯化铁、亚硫酸铁、过氧化氢 分析纯，天津市化学试剂三厂;DPPH标样 分析纯，美国Sigma公司;甲醇、水杨酸钠 分析纯，天津市风船化学试剂公司;铁氰化钾 分析纯，中国成都化学试剂厂;三氯乙酸 分析纯，前进化学试剂厂;卵磷脂 国药集团化学试剂有限公司;硫代巴比妥酸 国药集团化学试剂有限公司;盐酸 分析纯，重庆川东有限公司;L－抗坏血酸 分析纯，中国南化化学试剂厂。

电子天平 感量为0.0001g，沈阳龙腾电子有限公司;水浴锅 HH－60，常州市普达教学仪器有限公司;恒温电热干燥箱101－3ABS，北京市永光明医疗仪器厂;海尔冰箱 BCD－208K/A，青岛;离心机 80－1，常州市华普达教学仪器有限公司;旋转蒸发仪 RE－52A，上海亚荣仪器厂;移液枪 10～100、100～1000μL，大龙医疗设备有限公司;真空泵 SHZ－Ⅲ，上海亚荣生化仪器厂;722分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶样的制备

1.2.1.1 晒青绿茶的加工(对照)鲜叶杀青→揉捻→太阳晒干→晒青绿茶。

表1 发酵前后茶叶样品的感官变化Table 1 Sensory change of different tea samples before and after fermentation

杀青是为了钝化酶的活性，晒青茶的汤色青绿明亮，口感强烈。

1.2.1.2 半发酵红茶的加工 鲜叶→萎凋(2～3h)→揉捻→发酵12h→半发酵红茶→烘干(65～75℃)→成品。成品汤色黄明亮微红，滋味浓强，收敛性强。

1.2.1.3 全发酵红茶的加工 鲜叶→萎凋(2～3h)→揉捻→发酵24h→全发酵红茶→烘干(65～75℃)→成品。成品汤色红浓明亮，滋味浓强，鲜爽。

1.2.2 普洱茶的发酵 称取晒青绿茶、半发酵红茶、全发酵红茶各2kg均匀喷洒蒸馏水560g，静置2h后用透气性食品薄膜包裹，置于45℃，相对湿度70%的全自动控制发酵箱中发酵40d，期间每10d翻一次堆，发酵结束后于60℃下鼓风干燥，得到不同发酵程度的普洱茶四翻，即所需茶样，分别命名为PU－ERH TEA 1、PU－ERH TEA 2、PU－ERH TEA 3。1.2.3 受试样品的提取

1.2.3.1 普洱茶茶粉的提取流程 100g茶样加入1kg沸水在75℃恒温条件下浸提2次→过滤→滤液→真空浓缩→真空冷冻干燥→茶粉

1.2.3.2 样品的处理 分别配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的样品溶液。

1.2.4 指标的测定方法

1.2.4.1 DPPH自由基清除力的测定 根据文献［9］，参照彭长连等人的方法测定。

1.2.4.2 还原力的测定 根据文献［10］参照莫开菊等人的方法测定。

1.2.4.3 羟基自由基清除率的测定 根据文献［11］，参照李颖畅等人的方法测定。

1.2.4.4 抑制脂质体过氧化活性的测定 根据文献［12］参照李颖畅等人的方法测定。

1.2.4.5 不同茶叶样品的感官评定 参照GB/T 23776－2009［13］茶叶感官审评方法(2009)进行感官评定。

1.2.5 数据分析 采用SPSS(17.0)统计软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵前后茶叶样品的感官变化

从表1中可以看出，发酵前后，三种普洱茶的感官均发生了变化，外表颜色和茶汤颜色都加深，与发酵前相比，在发酵后都具有陈香，滋味的变化都是苦味加重(全发酵的除外)，叶底颜色均加深。

2.2 三种普洱茶提取物的DPPH自由基清除效果

2.2.1 不同浓度的普洱茶提取物的DPPH自由基清除率 三种普洱茶茶具有很好的DPPH自由基清除能力(表2)，经SPSS统计分析，发现同组普洱茶提取物对DPPH自由基的清除率与浓度呈正相关，并且两两之间均达到了显著性差异(p＜0.05)。三种普洱茶对DPPH自由基清除能力有较大的差异，可以得出三种普洱茶对DPPH自由基清除能力顺序依次为:PUERH TEA 2＞PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 3。

表2 不同发酵原料、不同浓度的普洱茶提取物对DPPH自由基清除率的影响Table 2 Effect of different fermentation materials，different concentrations of Pu－erh tea extract on DPPH free radical clearance

2.2.2 不同pH的普洱茶提取物的DPPH自由基清除率 不同pH的普洱茶提取物对DPPH自由基的清除率如表3所示，普洱茶提取物浓度为1mg/mL，DPPH自由基浓度为0.1mg/mL。随着pH的增大，三种普洱茶提取物对DPPH自由基的清除率呈下降趋势，经SPSS统计分析，两两之间均达到了显著性差异(p＜0.05)。pH＞8.0后，三种普洱茶提取物对DPPH自由基清除率急剧下降，其中以半发酵红茶为原料的普洱茶提取物受pH影响变化最大。

据报道茶多酚有较好的耐酸性，在pH 2～7范围内均十分稳定，光照或pH大于8时易氧化聚合［14］，全发酵红茶的重要成分茶黄素较不稳定，且在碱性条件及沸水里易降解(常温及酸性条件下较稳定)［15］，实验结果与研究结果相符。

2.3 普洱茶提取物还原力的测定

对不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)的普洱茶提取物的还原力进行研究，结果如表4所示。SPSS统计分析，发现三种普洱茶提取物的还原力均与浓度呈正相关，并且两两之间均达到了显著性差异(p＜0.05)，这与DPPH清除率结果一致。结果表明，三种普洱茶提取物还原力顺序依次为:PU－ERH TEA 2＞PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 3。

表3 不同发酵原料、不同pH的普洱茶提取物对DPPH自由基清除率的影响Table 3 Effect of different fermentation materials and different pH of Pu－erh tea extract on DPPH free radical clearance

表4 不同发酵原料、不同浓度的普洱茶提取物的还原力(OD)Table 4 Effect of different fermentation materials，different concentrations of Pu－erh tea extract on reducing power

2.4 三种普洱茶提取物的清除羟基自由基的能力

对不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)的茶叶提取物对羟基自由基的清除率如表5所示。实验结果显示，随着浓度的增加，PU－ERH TEA 1和PU－ERH TEA 3提取物对羟基自由基的清除率均有不同程度的降低，而PU－ERH TEA 2对羟基自由基清除率的效果呈不规则变化。经SPSS分析，同组茶叶提取物两两之间均有不同程度的显著性差异(p＜0.05)。从表5可以看出，三种普洱茶提取物对羟基自由基清除率没有得到很好的差异性，总体来说，对羟基自由基的清除能力大小依次为:PU－ERH TEA 2＞PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 3。

表5 不同发酵原料、不同浓度的普洱茶提取物清除羟基自由基的效果Table 5 Effect of different fermentation materials，different concentrations of Pu－erh tea extract on clear of hydroxyl radicals

2.5 普洱茶提取物脂质体过氧化抑制率的测定

对不同浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL)的茶叶提取物对脂质体过氧化抑制率如表6所示。从实验结果可以看出，浓度在0.02～0.04mg/mL范围内，抑制脂质体过氧化能力依次是PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 3＞PU－ERH TEA 2;浓度在 0.06～0.10mg/mL范围内，抑制脂质体过氧化能力依次是PU－ERH TEA 3＞PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 2;随着提取物浓度增大，三种茶叶提取物对脂质体抑制率不断增大，但PU－ERH TEA 2变化较小。

表6 不同发酵原料、不同浓度的普洱茶提取物的脂质体过氧化抑制率Table 6 Effect of different fermentation materials，different concentrations of Pu－erh tea extract on the liposome raise inhibition rate

3 结论

以不同浓度、不同原料(晒青绿茶、半发酵红茶、全发酵红茶)发酵的普洱茶提取物都具有清除DPPH自由基的能力，其能力顺序依次为以半发酵红茶发酵的普洱茶＞以晒青绿茶发酵的普洱茶＞以全发酵红茶发酵的普洱茶;当普洱茶提取物浓度为1mg/mL时，随着pH的增大，三种普洱茶提取物对DPPH自由基的清除率呈下降趋势，且两两之间差异显著(p＜0.05)，pH＞8后，三种普洱茶提取物对DPPH自由基清除率急剧减小，其中以半发酵红茶为原料的普洱茶提取物受pH影响变化最大;三种提取物均具有有较强的还原力，并与浓度呈正相关，且两两之间差异显著(p＜0.05)，还原力顺序依次为:以半发酵红茶发酵的普洱茶＞以晒青绿茶发酵的普洱茶＞以全发酵红茶发酵的普洱茶;三种普洱茶提取物都具有清除羟基自由基的作用，清除羟基自由基的能力依次为:以半发酵红茶发酵的普洱茶＞以晒青绿茶发酵的普洱茶＞以全发酵红茶发酵的普洱茶;三种普洱茶提取物都具有抑制脂质体过氧化的作用，在浓度0.02～0.04mg/mL范围内，抑制脂质体过氧化能力大小依次为:以晒青绿茶发酵的普洱茶＞以全发酵红茶发酵的普洱茶＞以半发酵红茶发酵的普洱茶;在浓度0.06～0.10mg/mL范围内，抑制脂质体过氧化能力大小依次为:以全发酵红茶发酵的普洱茶＞以晒青绿茶发酵的普洱茶＞以半发酵红茶发酵的普洱茶;随着提取物浓度增大，三种茶叶提取物对脂质体抑制率不断增大，但以半发酵红茶发酵的普洱茶变化较小。由此可知，三种以不同发酵原料发酵的普洱茶都具有抗氧化作用，且都与普洱茶提取物浓度呈现良好的量效关系，其中以半发酵红茶为原料发酵的普洱茶的抗氧化作用较好。

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