树脂法提取纯化白藜芦醇的新工艺研究

徐月灿，马德新

湖南希尔天然药业有限公司，永州425000

白藜芦醇(resveratrol，Res．)，化学名称为 3，4'，5-三羟基-二苯乙烯(3，4'，5-trihydroxystilbene)。其别名为虎杖甙元，又称芪三酚，分子式为C14H12O3，其相对分子质量为228．25，纯品为无色针状结晶，熔点为256～258℃，在261℃以上易升华。其药理作用为:抗菌、抗氧化、预防心脏病、抗癌、抗血小板凝聚、保护肝脏、雌激素作用、防辐射、免疫调节、抗艾滋病活性等［1］。目前，白藜芦醇的市场竞争非常激烈，提取纯化白藜芦醇的方法很多，但都采用先酶解再有机溶剂萃取或者柱层析提纯工艺［2，3］，生产成本高，产品收率低，不适用于工业化大生产。为了解决提取白藜芦醇工艺中存在的上述问题，提高市场的竞争力，该文采用树脂［4］法从虎杖中提取高含量的白藜芦醇，工艺简单，生产周期短，生产成本低，更适合于工业化大生产。

1 材料与仪器

1．1 实验材料

虎杖原药材购自湖北恩施;白藜芦醇对照品购自中国药品生物制品检定所;各种大孔树脂购自西安蓝晓科技有限公司;酿酒曲购自安琪酵母股份有限公司;其余试剂均为分析纯。

1．2 实验仪器

玻璃树脂柱尺寸:20 mm×420 mm(自制);安捷伦高效液相色谱仪(HPLC，美国安捷伦公司);N-1001旋转蒸发仪(上海爱郎仪器仪器有限公司);真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);四孔水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂);AG135分析电子天平(梅特勒托利多仪器有限公司)。

2 实验方法

2．1 白藜芦醇的提取纯化

取200 g原料粗粉，加入1 g酿酒曲，再加入750 mL水充分摇匀，置于35～40℃水浴中浸泡过夜，接近24 h后，将水酶解液放下来，然后将药渣加75%乙醇回流提取，提取三次，每次1 h，合并三次提取液，经回收乙醇，浓缩至500 mL，离心过滤后，滤液上已处理好的XC-7大孔树脂柱，柱体积100 mL，上完药液后，用3倍量树脂体积的10%乙醇洗脱，最后用5倍量树脂体积的60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，经回收乙醇减压浓缩至稠膏，真空干燥即得产品。

2．2 HPLC检测白藜芦醇含量

2．2．1 色谱条件

色谱柱为ODSC18柱;流动相为乙腈-水(25∶75)，流速1．0 mL/min，检测波长307 nm，进样量为10μL。

2．2．2 系统适用性实验

分别取对照品溶液、供试品溶液，按上述色谱条件分别进样，如图1，理论板数按白藜芦醇峰计不低于3000。

图1 白藜芦醇标准品(A)及白藜芦醇样品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of resveratrol standard(A)and resveratrol sample(B)

2．2．3 线性关系考察

精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8和10μL，注入液相色谱仪。按上述色谱条件测定，以对照品峰面积Y为纵坐标，以对照品进样量X为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=238722x－4597，r=0．9997。线性范围为白藜芦醇0．03 ～0．15 μg。

2．2．4 精密度实验

精密吸取对照品溶液，按上述色谱条件，同法连续测定6次，测得白藜芦醇峰面积的RSD为0．94%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2．2．5 稳定性实验

取同一白藜芦醇供试品溶液，按上述检测条件，分别于0、4、8和12 h时间间隔进行测定，分别测定峰面积，计算得白藜芦醇峰面积的RSD为1．12%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2．2．6 加样回收率实验

分别称取已知白藜芦醇含量的供试样品共6份，照供试品溶液制备，分别加入白藜芦醇对照品溶液4 mL，测定结果平均回收率为101．23%，RSD为1．15%(n=6)。

2．2．7 重复性实验

取同一批次的虎杖原药材粗粉，分为5份，按2．1项下方法制备供试品溶液共5份，并在上述色谱条件下进行测定，测定结果为样品中白藜芦醇含量平均值为85%，RSD为0．95%，结果表明方法重复性较好。

2．2．8 对照品溶液的制备

取白藜芦醇对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL含15μg的溶液，即得。

2．2．9 供试品溶液的制备

精密称取按2．1方法试验下来的产品5 mg，精密加入稀乙醇50 mL，超声溶解，滤过，取续滤液，即得。

2．2．10 样品测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

3 结果与讨论

3．1 酶解物的选择

不同酶解物对虎杖原药材进行对比酶解实验，结果表明，在24 h内酶解最完全的为酿酒曲，见表1。

3．2 纯化白藜芦醇的不同树脂实验

不同树脂对虎杖提取药液中白藜芦醇的除杂纯化比较，结果表明，XC-7大孔吸附树脂对白藜芦醇纯化最好，纯化的白藜芦醇含量远远超过其它树脂的纯化结果。结果见表2。

3．3 XC-7大孔树脂对白藜芦醇的动态吸附

准确量取 XC-7大孔树脂100 mL，湿法装柱(φ2 cm ×50 cm)，用95%乙醇浸泡24 h，并加水淋洗至无醇味。将白藜芦醇质量浓度为4．48 mg/mL的样液，以10 mL/min上样，同时控制洗脱液体积流量10 mL/min，每100 mL接一管，进行HPLC法检测，结果见图2。当上样量达到800 mL时，流出液中白藜芦醇的质量浓度与样液中的一致，表明此大孔树脂的吸附已经达到饱和。计算得出此大孔树脂对白藜芦醇的动态吸附量为22．4 mg/mL湿树脂。

表1 不同酶解物酶解情况Table 1 Enzymolysis resultswith different enzyme substrate used

表2 不同树脂对白藜芦醇纯化结果Table 2 Resveratrol purification resultswith different resins

图2 XC-7大孔树脂对白藜芦醇的动态吸附曲线Fig.2 Dynamic adsorption curve of resveratrol on XC-7 macroporous resin

3．4 白藜芦醇的洗脱

为研究乙醇对白藜芦醇的洗脱性能，取白藜芦醇质量浓度为4．48 mg/mL的提取液500 mL进行大孔树脂分离，树脂柱规格同3．3项下的。分别用10%、30%、50%、60%、70%乙醇各3BV洗脱，洗脱流速为10 mL/min，每100 mL接一管，进行 HPLC法检测，结果见图3。300～600 mL洗脱液为30%乙醇，600～900 mL洗脱液为50%乙醇，900～1200 mL洗脱液为60%乙醇，可见白藜芦醇主要被30%～60%乙醇洗脱。

图3 乙醇对XC-7大孔树脂上的白藜芦醇洗脱Fig.3 Elution of resveratrolon XC-7macroporous resin with ethanol

4 结论

先将原药材酶解，再利用树脂对白藜芦醇的吸附，只需简单设备几步就可以将白藜芦醇含量提高到85%以上，与传统的萃取重结晶纯化工艺相比，该法具有有工艺简单易行，操作安全方便，产品收率高，生产成本低的特点。

树脂法从虎杖中提取高含量白藜芦醇的最佳工艺:用酿酒曲于35～40℃将原药材先酶解24 h，再用75%乙醇提取，提取液经回收乙醇后上XC-7大孔树脂柱，先加10%乙醇洗脱，然后再用60%乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩，真空干燥即可，产品中白藜芦醇含量达85%，白藜芦醇转化率达85%以上。

1 Zeng CZ(曾超珍)，Liu ZX(刘志祥)，Wu YH(吴耀辉)，et al．Research developments in extraction technology and determination of resveratrol from Polygonum cuspidatum．Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药)，2007，18:2992-2993．

2 Deng MR(邓梦茹)，Liu S(刘韶)，Zhu ZJ(朱周觐)．Optimization of resveratrol from Polygonum cuspidatum by enzyme-assisted extraction．Central South Pharm(中南药学)，2011，9:699-672．

3 Xing H(邢花)，Tan Q(谭琴)．Development research in resveratrol extraction and purification and its biological activity．Culinary Sci JYangzhou Univ(扬州大学烹饪学报)，2011，28(2):57-60．

4 Wang H(王辉)，Dong RS(董悦生)，Qin JQ(秦建全)，et al．Isolation and purification of resveratrol from fermentation broth of Polygonum cuspidatum．Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2010，41:223-227．