罕见α-地中海贫血的新生儿筛查与诊断

唐海深江陵陆林苑熊怡李东至

（1.南方医科大学附属中山市博爱医院产前诊断中心，广东中山 528400；2.广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心，广东广州 510623）

罕见α-地中海贫血的新生儿筛查与诊断

唐海深1江陵1陆林苑1熊怡1李东至2

（1.南方医科大学附属中山市博爱医院产前诊断中心，广东中山 528400；2.广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心，广东广州 510623）

目的探讨罕见α-地中海贫血的新生儿筛查与诊断。方法应用全自动毛细管电泳技术对6525例新生儿脐血进行血红蛋白定量分析，有Hb Bart’s区带的样本进行常规基因诊断（gap-PCR和PCR-RDB），对于未检出异常的样本，用多重PCR技术检测4种罕见α-基因缺失（--THAI、--FIL、--MED、-（α）20.5），用PCR产物直接测序法检测罕见非缺失型α-地贫。结果6525例新生儿脐血样本中，检出Hb Bart’s阳性样本377例，其中基因确诊375例：包括14种基因型、383个α-地贫等位基因；发现罕见α-地贫7例，包括2例--THAI／αα及5例罕见非缺失型α-地贫；发现1例α2-基因突变至与Hb Bart’s区带峰同区域的异常血红蛋白（Hb J-Wenchang-Wuming）。结论毛细管电泳技术定量分析血红蛋白，准确、高效，应作为α-地贫高发地区的新生儿疾病筛查常规项目；在α-地贫高发地区应注意罕见α-地贫的筛查与诊断，防止漏诊导致重型地贫儿出生。

α-地中海贫血；罕见；Hb Bart’s；基因

α-地中海贫血（α-thalassemia，α-地贫）是人类最常见且危害最大的单其因遗传病之一，它是由于α-珠蛋白基因缺失或非缺失突变使α-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血。正常人有4个α基因，若4个α-基因都缺失，则完全没有α-珠蛋白链的合成，临床上称为血红蛋白Bart’s胎儿水肿综合征，胎儿一般在妊娠23～38周或出生后数小时死亡。另外，一些非缺失型Hb H病和非缺失型α-地贫纯合子患儿贫血严重，甚至需要输血治疗。因此在α-地贫高危地区筛查--／αα基因和非缺失型α-地贫基因携带者尤为必要，是识别高危人群，预防重型地贫患儿出生的重要手段。目前各分子实验室常规应用gap-PCR技术检测3种常见缺失型α-地贫基因（--SEA、-α3.7、-α4.2），采用反向点杂交（RDB）技术检测3种常见非缺失型α-地贫基因（αCSα、αQSα及αWSα），但仍可能漏诊罕见的α-地贫，导致重型地贫儿的出生。本文探讨罕见α-地贫的新生儿筛查与诊断。

1 资料和方法

1.1 研究对象 2010年5月至2011年7月在广州市妇女儿童医疗中心产科分娩的6525例新生儿。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 新生儿分娩断脐后，从胎盘端脐带抽吸2 ml脐带血，EDTA-K2抗凝，用于血红蛋白电泳及地贫基因检测。

1.2.2 毛细管电泳Hb Bart’s定量 脐血样品先3000转离心3分钟，取18μl血细胞溶于90μl的溶血素中充分混匀后上机检测。采用法国Sebia公司Capillarys 2全自动毛细管电泳仪及配套试剂，在9.8 k V电压、p H9.4的碱性缓冲液条件下，在石英毛细管内进行血红蛋白电泳，用415 nm波长检测各种血红蛋白的百分比，从而定量Hb Bart’s。电泳图谱分成15个区：不同的血红蛋白峰出现在特定的区域内：Hb A2＝Z3，Hb F＝Z7，Hb A＝Z9，Hb Bart＇s＝Z12，Hb H＝Z15［1，2］。

1.2.3 常规基因诊断 收集Hb Bart’s阳性样本并编号，用富士quick gene-mini80DNA提取仪，按DNA提取试剂盒使用说明，提取新生儿脐血中白细胞的全基因组DNA。采用gap-PCR技术检测3种常见缺失型α-地贫基因（--SEA、-α3.7、-α4.2）［3］；若gap-PCR检测阴性，用反向点杂交（RDB）技术检测3种非缺失型地贫基因（Hb CS、Hb QS和Hb WS）［4］。

1.2.4 罕见α-地贫基因检测

1.2.4.1 4种罕见的缺失型α-地贫基因检测 对于gap-PCR及PCR-RDB方法均未检出异常的Hb Bart’s阳性样本，参照文献设计引物（详见表1）［5］，用一种快速可靠的多重PCR检测4种中国人群罕见的缺失型α-地贫基因（--THAI、--FIL、--MED、-（α）20.5）。PCR反应总体积为10μl，包括：5μl 2×GC buffer I、250μM d NTP、正反向引物各0.16μM、Taq DNA聚合酶0.5U、15～25 ng基因组DNA模板。PCR反应条件：96℃预变性15分钟；随后98℃变性45秒，60℃退火90秒，72℃延伸135秒，共30个循环；然后72℃延伸5分钟；最后4℃保存。随后配置2%琼脂糖凝胶板，对PCR产物进行电泳并分析结果。

表1 检测4种罕见缺失型α-地贫基因（--THAI、--FIL、--MED、-（α）20.5）的引物序列

1.2.4.2 罕见非缺失型α-地贫基因检测 挑出通过以上方法仍未知基因型的Hb Bart’s阳性样本。从UCSC数据库（http：／／genome.ucsc.edu）中获取α-珠蛋白基因（α1-和α2-基因）的DNA序列。应用LightScanner Primer Design软件设计两对引物，分别扩增α1-和α2-珠蛋白基因（包含3个外显子及部分上游和下游序列），引物序列详见表2，引物委托华大基因合成。PCR扩增：α1-和α2-基因的PCR反应体系相同，总体积为50μl（包括：25μl 2×GC buffer I、750μM d NTP、正反向引物各6.4p M、Taq DNA聚合酶2.0U、100ng基因组DNA模板）。扩增α1-基因的PCR反应条件：95℃预变性5分钟；随后95℃变性40秒，62.5℃退火40秒，72℃延伸100秒，共35个循环；然后72℃延伸3分钟；最后4℃保存。扩增α2-基因的PCR反应条件：95℃预变性5分钟；随后95℃变性40秒，65℃退火40秒，72℃延伸100秒，共35个循环；然后72℃延伸3分钟；最后4℃保存。PCR扩增完成后，先取2～3μl产物用2%琼脂糖凝胶电泳，确定成功扩增并获得特异性片段后，将剩余PCR产物送华大基因用PCR产物直接测序法检测α-基因（α1-和α2-基因）全长。用chromas及clustalx软件分析DNA测序结果。

表2 α-珠蛋白基因全长测序所用的引物

1.2.5 统计 采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。

2 结 果

2.1 Hb Bart’s阳性率及α-地贫的人群携带率在6525例新生儿脐带血样本中，检出Hb Bart’s阳性样本377例（Hb Bart’s含量为0.1%～22.5%），阳性检出率为5.78%。377例Hb Bart’s阳性样本中，共检出14种α-地贫基因型375例，α-地贫的人群携带率为5.75%（375／6525）。375例确诊的α-地贫携带者中包括双重杂合子8例，即α-地贫等位基因为383个，α-地贫基因携带率为5.87%（383／6525）。

2.2 Hb Bart’s含量与常见α-地贫基因型的关系α＋-地贫（1个α-基因缺陷）的Hb Bart’s的含量为0.55%±0.29%，其中-α3.7／αα、-α4.2／αα、αCSα／αα、αQSα／αα的Hb Bart’s含量分别为0.39%±0.21%（0.10%～0.90%）、0.50±0.16（0.20～0.90）、1.59%±0.32%（1.00%～2.30%）、0.48%± 0.18%（0.20%～0.70%）；α0-地贫（2个α-基因缺陷）的Hb Bart’s的含量为3.54%±0.79%（1.0～8.6）；Hb H病（3个α-基因缺陷）的Hb Bart’s的含量为20.27%±1.72%（17.5～22.5）。

2.3 罕见α-地贫基因型及Hb Bart’s含量 全部377例Hb Bart’s阳性样本经gap-PCR及RDB技术检测以后，检出368例常见α-地贫基因型，剩余9例样本未检出异常，另外有1例检测基因型为-α4.2／αα的样本Hb Bart’s含量为4.6%。将上述10例样本全部挑出，用多重PCR检测4种中国人群罕见的缺失型α-地贫基因（--THAI，--FIL，--MED，-（α）20.5），检出2例--THAI／αα。对于剩余8例样本用PCR产物直接测序法检测α1-和α2-珠蛋白基因的全长，共检出5例4种罕见α-基因突变：［α1CD62 Val→Ala，GTG＞GCG］、［α2CD8（-C）］、［α1CD117／CD118（＋ATC）］、［α2CD31 Arg→Lys，AGG＞AAG］。Hb Bart’s含量4.6%通过gap-PCR、PCR-RDB及多重PCR技术检测基因型为-α4.2／αα的样本，进行了α-基因全长测序，检出α2-基因突变（α2CD11 AAG＞CAG）至与Hb Bart’s区带峰同区域的异常血红蛋白（HB J-Wenchang-Wuming），详见表3。

表3 罕见α-地贫基因型及其Hb Bart’s含量

2.4 α-地贫等位基因的组成 在383个α-地贫等位基因中，包括东南亚缺失型（--SEA）263例、-α3.769例、-α4.222例、αCSα12例、αQSα10例，罕见α-地贫7例，详见表4。

表4 383个α-地贫等位基因的组成

3 讨 论

由于人类珠蛋白基因的表达具有时空顺序性，人在不同发育时期血红蛋白组成不同，成人期血红蛋白组成为：Hb A（α2β2）：96.5%～97.5%，Hb A2（α2δ2）：2.5%～3.5%，HbF（α2γ2）：0～1.0%；正常新生儿的血红蛋白组成大约为：Hb F（α2γ2）：70%～80%，Hb A（α2β2）：20%～30%。若α-珠蛋白链减少或缺乏会导致γ-珠蛋白链的相对增多，未与α-链结合的γ-链聚合成Hb Bart’s（γ4）。自1958年Ager等发现脐血中存在Hb Bart’s以来，此成分与α-珠蛋白基因缺陷间的关系引起了许多学者的关注。由于Hb Bart’s于出生3～6个月后即消失，理论上α-地贫的筛查最适合于新生儿期进行。

本研究应用法国Sebia公司Capillarys 2全自动毛细管电泳仪对新生儿脐血进行血红蛋白电泳Hb Bart’s定量，377例Hb Bart’s阳性样本中（Hb Bart’s含量为0.1%～22.5%），有375例经基因分析确诊为α-地贫。经分析Hb Bart’s的含量随着α-基因缺陷（缺失或突变）个数的增加而升高：Hb H病的Hb Bart’s含量均大于10%；α0-地贫的Hb Bart’s的含量均大于1%且小于10%；α＋-地贫中，αCSα／αα的Hb Bart’s含量均大于1%，其他类型的α＋-地贫携带者Hb Bart’s含量均小于1%。因此，以脐血Hb Bart’s阳性为指标，对新生儿进行α-地贫筛查，灵敏度高；同时，全自动毛细管电泳技术分离定量Hb Bart’s具有简便、高效、准确的特点，在α-地贫高发地区，该技术应常规应用于新生儿α-地贫筛查，以减少出生缺陷，提高人口素质。

2010年Munkongdee T等［1］对587例泰国新生儿脐血进行毛细管电泳电泳Hb Bart’s定量筛查α-地贫。研究显示，缺失1、2、3个α-基因的α-地贫携带者，其脐血Hb Bart’s含量分别为0.5%± 0.2%、4.6%±0.5%、20.1%；该研究还显示，以Hb Bart’s含量0.2%为界，区分正常人与α＋-地贫携带者的效率最高。本研究结果中Hb Bart’s的含量与基因缺陷个数的关系与Munkongdee T的研究相符，但是，本研究以Hb Bart’s含量0.1%为界区分正常人与α-地贫携带者，Hb Bart’s阳性样本377例，即有375例经基因分析确诊为α-地贫。2例Hb Bart’s阳性的样品未知基因型（Hb Bart’s含量分别为0.60%、0.30%），还可能存在-α3.7及-α4.2以外的其他罕见缺失型α＋-地贫未检测到［9］，或存在直接测序法检测α1-和α2-基因全长无法检测到的，影响α-基因表达的上游突变所致的非缺失型α＋-地贫或Z12区段异常血红蛋白。此外，其中4例Hb Bart’s含量为0.1%样本基因检测均为-α3.7／αα。因此，新生儿脐血毛细管电泳Hb Bart’s含量0.1%应作为区分正常人与α-地贫携带者的指标。

本研究检出的383个α-地贫等位基因中，3种常见的缺失型α-地贫（--SEA、-α3.7、-α4.2）共354例，3种常见的非缺失型α-地贫（αCSα、αQSα、αWSα）共22例。用多重PCR检出2例--THAI／αα。通过用PCR产物直接测序法检测α1-和α2-珠蛋白基因的全长，共检出5例4种罕见非缺失型α-地贫。可见广州地区罕见α-地贫（包括罕见非缺失型α-地贫与4种罕见缺失型）的发病率为0.1%（7／6525）。联合应用gap-PCR技术和反向点杂交技术能检测出约98%（376／383）的α-地贫，仍有2%（7／383）左右的罕见α-地贫漏诊，因此日常临床应注意罕见α-地贫的筛查与诊断，防止重型地贫儿的出生。

在研究进行过程中，1例血红蛋白电泳显示Hb Bart’s区带峰的血红蛋白含量为4.6%的样本通过gap-PCR、PCR-RDB及多重PCR技术检测基因型为-α4.2／αα，回顾查看其父母的血常规：双方Hb、MCV、MCH均在正常范围。随后便对此例样本进行了α-基因全长测序，发现α2-基因突变（CD11 Lys→Gln，AAG＞CAG），导致产生异常血红蛋白（HB J-Wenchang-Wuming），此血红蛋白在毛细管电泳时与Hb Bart’s区带峰区域相同。可见，脐血Hb Bart’s是新生儿α-地贫筛查的敏感指标，但临床上应将血常规、血红蛋白电泳与基因诊断相结合，同时应注意Hb Bart’s区带峰同区域的异常血红蛋白，以降低假阳性带来的不良影响。

［1］Munkongdee T，Pichanun D，Butthep P，et al.Quantitative analysis of Hb Bart＇s in cord blood by capillary electrophoresis system［J］.Ann Hematol，2011，90（7）：741-746.

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编辑：邹刚

ObjectiveTo explore the methods and significance for neonatal screening and diagnosis about rareα-thalassemia.MethodAutomatic capillary electrophoresis（CE）was used to determinate Hb Bart’s amount in cord blood of 6525 newborns.Samples with the presence of Hb Bart’s were confirmed by routine molecular analysis（gap-PCR and PCR-RDB）.For samples of unknown genotype after gap-PCR and PCR-RDB，use a Multiplex PCR to detect four kinds of deletionalα-thalassemia（--THAI，--FIL，--MED，-（α）20.5），then do gene sequencing for the wholeα1-globin gene andα2-globin gene.ResultsTotally，377 samples were found positive for Hb Bart’s，and 375 samples were confirmed by DNA testing，including 14 genotypes with 383α-thalassemia alleles.7 rareα-thalassemia genes were detected，including 2--THAI／αα and 5 rare nondeletion type ofα-thalassemia.At the same time，1 sample with Hb J-Wenchang-Wuming，witch was appear at the same position with Hb Bart’s，was detected..ConclusionsTo screen forα-thalassemia，CE was proved to be an effective and accurate method.To prevent birth defects about hydrops fetalis or babies with transfusion-dependentα-thalassemia，rareα-thalassemia genotypes should be taken for suspected cases in high prevalence areas.

α-thalassemia；rare；Hb Bart’s；gene

R714.55

A

2013-12-05）