蚕沙中1-脱氧野尻霉素提取工艺研究*

吕寒,马丽,任冰如,陈剑,李维林,刘艳

(江苏省中国科学院植物研究所,江苏省抗糖尿病药物筛选服务中心,南京 210014)

蚕沙中1-脱氧野尻霉素提取工艺研究*

吕寒,马丽,任冰如,陈剑,李维林,刘艳

(江苏省中国科学院植物研究所,江苏省抗糖尿病药物筛选服务中心,南京 210014)

目的 优化蚕沙中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的提取工艺。方法通过高效液相色谱法测定DNJ含量,比较不同溶剂、提取方法、提取次数对DNJ含量的影响,并通过正交实验方法比较不同因素的影响。结果在提取效果的影响因素中,影响程度大小依次为盐酸浓度>提取时间>提取温度。蚕沙中DNJ提取最佳工艺为:10倍0.1 mol·L-1盐酸为提取溶剂,80℃水浴加热提取2次,每次1 h。结论该提取工艺提取率高,稳定可靠,可用于蚕沙中DNJ的提取。

蚕沙;1-脱氧野尻霉素;提取工艺

蚕沙为家蚕(Bombyx moriL.)幼虫蚕食桑叶后排泄出来的粪便[1],始载于《名医别录》,《本草纲目》列于虫部。蚕沙有祛风除湿、清热明目、活血定痛的功能,在一些治疗糖尿病的复方中常使用蚕沙[2]。研究表明,蚕沙总生物碱具有抗糖尿病作用[3],而蚕沙总生物碱中主要成分为1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin,DNJ),具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,是蚕沙治疗糖尿病的主要有效成分[4]。笔者在本实验中应用正交实验方法比较不同提取条件对DNJ提取率的影响,以期为开发蚕沙中生物碱类成分提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Mettler EL204电子天平,Dionex-Ultimate 3000高效液相色谱仪,Alltech3300 ELSD检测器。

1.2 试剂与药品 蚕沙[收集于江苏省南通市,自然晾干后,除去石灰、沙子等杂质,批号:20100612,由李维林研究员鉴定为家蚕(Bombyx moriL.)幼虫的粪便]。DNJ(由本所从蚕沙中提取精制,经液相色谱检测,含量为98.5%),001×7强酸型阳离子交换树脂(国药集团化学试剂有限公司,批号:20120108),乙腈(美国天地公司,色谱纯,批号:1012441),水为超纯水,乙醇(南京化学试剂厂,批号:1002411526)、盐酸(南京化学试剂厂,批号:10031130170)均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 不同溶剂比较 取蚕沙2.5 g精密称定,5份,分别加入0.01 mol·L-1盐酸、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇,均25 mL,50℃超声提取1 h,提取液滤过,减压浓缩蒸干。干浸膏以0.01 mol·L-1盐酸10 mL溶解,通过001×7强酸型阳离子交换树脂,以水洗脱至pH中性,再以0.5 mol·L-1氨水30 mL洗脱,收集氨水洗脱液,减压浓缩蒸干。干浸膏以纯水溶解,转移至10 mL量瓶,以水定容。溶液以0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。按“2.4”项方法检测含量。提取率(%)=氨水洗脱干浸膏中DNJ含量(mg)/蚕沙药材中DNJ含量(mg)×100%。

2.2 不同提取方法比较 取蚕沙2.5 g2份精密称定,分别加入0.01 mol·L-1盐酸25 mL。其中一份以50℃超声提取1 h,一份以100℃水浴提取1 h,提取液滤过,减压浓缩蒸干。其余操作同“2.1”项。

2.3 不同提取次数比较 取蚕沙2.5 g2份精密称定,分别加入0.01 mol·L-1盐酸25 mL。1份以100℃水浴提取1 h,另1份以100℃水浴提取2次,每次1 h,提取液滤过,减压浓缩蒸干。其余操作同“2.1”项。

2.4 含量测定

2.4.1 对照品溶液的配制 取DNJ对照品精密称定,加超纯水溶解,配制成0.29 mg·mL-1对照品溶液。

2.4.2 色谱条件 色谱柱为Inerstil NH2(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流动相为乙腈-水(80∶20);流速1.0 mL·min-1;柱温35℃;进样量20 μL。ELSD检测器参数:漂移管温度50℃,载气流速1.5 L·min-1。

2.4.3 标准曲线的绘制 分别吸取对照品溶液5, 10,15,20,25,30 μL,注入液相色谱仪,按“2.4.2”项色谱条件,测定峰面积,以对照品进样量为横坐标(X),峰面积积分值为纵坐标(Y),进行线性回归。得回归方程分别为:Y=225 588X-112 834(R2=0.999 8),结果DNJ在1.45～8.7 μg内线性关系良好。

2.4.4 精密度实验 精密吸取对照品溶液,在上述色谱条件下重复进样6次,每次20 μL,对照品峰面积RSD为0.75%,说明该仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性实验 精密吸取供试品溶液,在上述色谱条件下分别于0,2,4,8,12,24 h进样测定,结果DNJ含量RSD为2.5%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 重复性实验 取蚕沙2.5 g6份精密称定,分别加入0.01 mol·L-1盐酸25 mL,100℃水浴提取1 h,提取2次,其余操作同“2.1”项,在上述色谱条件下测定样品中DNJ含量,结果样品DNJ含量RSD为2.1%,说明该方法有很好的重复性。

2.4.7 加样回收率实验 取蚕沙1.25 g6份精密称定,分别精密加入对照品溶液(浓度2.9 mg·mL-1) 0.5 mL,分别加入0.01 mol·L-1盐酸25 mL,100℃水浴提取1 h,提取2次,其余操作同“2.1”项,在上述色谱条件下测定样品中DNJ含量,计算加样回收率,结果见表1。表明本方法回收率良好。

表1 DNJ的加样回收实验结果

2.5 正交实验 根据预实验结果,以盐酸浓度、提取温度、提取时间为实验因素,每个因素设3个水平,进行L9(34)正交实验(表2)。取2.5 g蚕沙9份精密称定,按正交表中条件分别加入不同浓度盐酸,分别以不同提取温度和提取时间水浴提取,滤过,得提取液,提取液滤过,减压浓缩蒸干,称重。干浸膏以0.01 mol·L-1盐酸10 mL溶解,并通过001×7强酸型阳离子交换树脂,以水洗脱至pH中性,再以0.5 mol·L-1氨水30 mL洗脱,收集氨水洗脱液,减压浓缩蒸干,称重。干浸膏以超纯水溶解,转移至10 mL量瓶,并以水定容至刻度。溶液以孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。按“2.4”项方法检测,计算DNJ含量。

表2 L9(34)实验因素水平表

2.6 结果与分析

2.6.1 不同溶剂比较 不同溶剂对DNJ提取率影响见表3。从结果中可见,随着乙醇浓度增加DNJ提取率明显下降,0.01 mol·L-1盐酸的提取率最高,所以选择稀盐酸溶液作为提取溶剂。

表3 不同溶剂DNJ提取率

2.6.2 不同提取方法比较 水浴加热提取和超声提取DNJ提取率分别为81.7%和70.8%,结果可见水浴加热较超声提取率高,所以选择水浴加热提取。

2.6.3 不同提取次数比较 1次提取和2次提取DNJ提取率分别为81.7%和87.1%,2次提取较1次提取的提取率高,所以选择2次提取。

2.6.4 正交实验结果 正交实验结果见表4,方差分析(表5)表明,酸浓度对叶DNJ含量有显著影响,提取温度和提取时间无显著影响,影响程度大小依次为盐酸浓度>提取时间>提取温度。直观分析最佳工艺条件是A1B3C1,由于提取时间无显著差异,从生产角度考虑,选择A1B3C3,即0.1 mol·L-1盐酸,80℃水浴提取2次,每次1 h。

表4 L9(34)正交实验结果

表5 方差分析结果

2.7 验证实验 按照优化的条件进行最佳工艺的验证实验,重复3次,结果DNJ提取率为91.1%,92.1%, 92.3%,平均提取率为91.8%。阳离子交换树脂氨水洗脱液干浸膏DNJ含量分别为2.61%,2.54%, 2.67%,平均含量为2.61%。表明正交实验所得的最佳工艺稳定,可行。

3 讨论

DNJ分子结构中不含发色团,在紫外和可见光范围内均无吸收,采用紫外检测器无法分析。目前多采用柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测法和柱前衍生化-紫外检测法,两者利用了特殊的荧光试剂芴甲氧羰酰氯(9-Fluorenylmethyl Chloroformate,FMOC-C1)与DNJ柱前衍生,使反应后的产物可以用荧光或紫外检测器来检测[5-6],但是衍生化技术操作繁琐、费时,需要考虑反应的相关条件及副产物的处理等问题。本实验采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法,该方法无需对样品进行衍生化,操作较简便,准确性和重复性较好。DNJ极性很大,用常规的C18色谱柱保留时间很短,本实验选用氨基柱,并通过优化色谱条件使主峰与杂质峰得到很好的分离。

预实验中发现蚕沙提取中有很多非生物碱类杂质,不经处理直接进行液相分析会影响检测,本实验采用阳离子交换的方法,可以有效去除非生物碱类杂质,减少后期液相分析的杂质干扰。

不同溶剂筛选结果可见,稀盐酸溶液对DNJ的提取率高于乙醇溶液,这和其极性大且为碱性的结构有关。本实验通过正交实验方法,确定了10倍0.1 mol·L-1盐酸为提取溶剂,80℃水浴加热提取2次每次1 h的最佳工艺。该工艺经过3次放大实验,重复性良好,为蚕沙中生物碱类开发提供了基础。

[1] 郭宝星.蚕沙及其提取物在医学上的应用[J].四川中医, 2003,21(3):19-21.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海人民出版社, 1988:1830-1831.

[3] 朱元元,白钢,朱文杰,等.一种蚕沙总生物碱及其制备方法:中国,200510122258.X[P].2005-12-09.

[4] 周光雄,阮杰武,黄关燕,等.蚕沙中生物碱成分研究[J].中药材,2007,30(11):1384-1385.

[5] JIN W K,S00 U K,HEUI S L,et al.Determination of 1-deoxlImojiriInvcin inMorus albaL.leaves by derivatization with 9-flurenylmethyl chlorofomate followed by reversedphase high-performance liquid chromatography[J].J Chrom A,2003,1002(1):93-99.

[6] 施新琴,崔为正,裘立群.用反相高效液相色谱-紫外检测法测定1-脱氧野尻霉素的含量[J].蚕业科学,2006,32 (1):146-149.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.029

R286;TQ460.1

B

1004-0781(2014)11-1506-03

2013-11-15

2013-12-20

*江苏省科技支撑计划-社会发展项目(BE2011787);江苏省科技基础设施建设计划-科技公共服务平台项目(BM2011117)

吕寒(1980-),女,浙江永康人,助理研究员,硕士,主要从事植物有效成分分离。电话:025-84347081,E-mail:xiaohan1814@163.com。

李维林(1966-),男,陕西汉中人,研究员,博士,主要研究方向为经济植物引种驯化、成分分离。电话:025-84347002,E-mail:lwlcnbg@mail.cnbg.net。