艾叶发酵物治疗系统性白念珠菌感染*

白静,胡雷,张丽,田春雨,庞得全,薄海美,韩淑英

(1.河北联合大学基础医学院药理系,唐山 063000;2.河北省唐山市工人医院麻醉科,唐山 063000)

艾叶发酵物治疗系统性白念珠菌感染*

白静1,胡雷1,张丽2,田春雨1,庞得全1,薄海美1,韩淑英1

(1.河北联合大学基础医学院药理系,唐山 063000;2.河北省唐山市工人医院麻醉科,唐山 063000)

目的 观察艾叶发酵物对系统性白念珠菌感染的治疗作用,并探讨其可能机制。方法建立免疫抑制小鼠系统性白念珠菌感染模型。将模型小鼠随机分为模型对照组,艾叶发酵物小、中、大剂量组(100,200,400 mg·kg-1)及氟康唑组(20 mg·kg-1),每组30只。小鼠灌胃给予相应治疗药物,bid,连续给药5 d。计算模型建立后21 d各组小鼠生存率,酶联免疫吸附(ELISA)法测定小鼠血清γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)水平,噻唑蓝(MTT)法检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性,平板计数法测定小鼠肝、肾组织活菌数目。结果与模型对照组比较,艾叶发酵物中、大剂量组和氟康唑组小鼠存活率,血清IFN-γ、IL-2水平及脾脏T淋巴细胞增殖活性均较高,而肝、肾组织白念珠菌数目较低(P＜0.01);与艾叶发酵物小剂量组比较,中、大剂量组和氟康唑组上述各指标变化更显著(P＜0.05或P＜0.01),但中、大剂量组与氟康唑组间比较,各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论艾叶发酵物200～400 mg·kg-1对系统性白念珠菌感染有一定治疗作用,其机制可能与其提高T淋巴细胞增殖活性及IFN-γ、IL-2水平相关。

艾叶发酵物;感染白念珠菌

艾叶为我国传统中药,具有除湿止痒、抗菌消炎、抗肿瘤等功效[1-2],为提高艾叶抗菌作用,笔者在本研究采用中药发酵技术,将艾叶制成艾叶发酵物,通过测定白念珠菌感染小鼠生存率及小鼠肝、肾组织中白念珠菌数目,考察艾叶发酵物对小鼠系统性念珠菌感染是否具有治疗作用。并通过测定小鼠脾脏T细胞增殖活性及血清γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)水平,考察该发酵物作用机制是否与增强免疫力相关。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级昆明小鼠,体质量18～22 g,雌性,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,实验动物合格证号:SCXK(京)2009-0008。饲养环境:温度25～26℃,相对湿度50%～60%,全新风单向流动,空气洁净度达1万级。

1.2 受试药物的制备 艾叶采自内蒙古通辽,经河北联合大学基础医学院韩淑英教授鉴定为菊科植物艾(Folium ArtemisiaeArgyi.)的干燥叶。艾叶水提物:将艾叶研碎,水浴加热煮沸2 h后,4层纱布过滤,滤渣继续浸煮2 h,将两次滤液合并,浓缩至每100 mL含生药100 g。艾叶发酵物:取高压灭菌后的增菌液体培养液(蛋白胨40 g,酵母浸粉20 g,葡萄糖40 g于1 000 mL纯化水中)于无菌容器内,无菌环境下加安琪干酵母100 g,置37℃恒温培养箱培养6 h。将活化增殖的酵母菌液加入等体积上述艾叶水提物、6%蛋白胨、6%葡萄糖,混合均匀后继续发酵。发酵条件:培养温度37℃,培养时间72 h。发酵结束后,将发酵物加入无水乙醇,使乙醇终浓度达到70%,在70℃萃取4 h,将提取液离心15 min,2 500 r·min-1(r=15 cm)。取上清液在旋转蒸发仪上回收乙醇,回收乙醇后的剩余液即为醇提后的艾叶发酵物。每100 mL艾叶发酵物含生药50 g。

1.3 试剂 氟康唑注射液(安徽双鹤药业有限责任公司生产,规格:100 mL含氟康唑0.2 g,氯化钠0.9 g,批号:1109184A)。注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司生产,规格:0.2 g,批号:11021821)。沙氏培养液(北京博星生物技术有限责任公司,批号: 20110826)。IFN-γ(批号:0706127)、IL-2(批号: 0706125)试剂盒由上海森雄科技实验有限公司提供。

1.4 菌株 白念珠菌临床新分离菌株,由开滦医院检验科提供并由河北联合大学微生物系李静副教授鉴定为白念珠菌株。经沙氏培养液培养48 h,置4℃冰箱保存备用。挑取新培养白念珠菌菌落混悬于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)液中,震荡使之充分混匀,应用血细胞计数板调节浓度至2× 106·mL-1。

1.5 仪器 MLS-3750高压灭菌器(日本SANYO产), HR40-IIA2生物安全柜(青岛海尔公司产),Coic倒置显微镜XDS-1B(重庆光电仪器有限公司产),二氧化碳(CO2)恒温培养箱2123TC(美国SHEL-LAB产)。

1.6 模型建立、分组给药及各组小鼠存活率测定 小鼠腹腔内一次性注射环磷酰胺200 mg·kg-1,每只0.2 mL,制备免疫抑制小鼠模型。4 d后经小鼠尾静脉注射2×106·mL-1白念珠菌菌液,每只0.2 mL[3]。将成模小鼠随机分为5组,即模型对照组,阳性对照组(氟康唑20 mg·kg-1),艾叶发酵物小、中、大剂量组(艾叶发酵物100,200,400 mg·kg-1),每组30只,其中10只用于测定存活率,20只用于测定其他各指标。各组小鼠灌胃给予相应药物0.2 mL·kg-1;模型对照组灌胃等体积纯化水。各组均连续给药5 d,bid。于给药第1天开始观察,计算各组小鼠在21 d内的存活率,并绘成曲线。

1.7 ELISA法测定各组小鼠血清IFN-γ与IL-2水平 于给药第6天将每组存活小鼠取8只,经眼球取血,离心得血清。采用酶标仪按试剂盒说明书测定血清IFN-γ、IL-2水平。

1.8 MTT法检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性 将小鼠颈椎脱臼处死,无菌取出小鼠脾脏,加入Hank's液研磨,以200目不锈钢网滤过,1 500 r·min-1离心(r=15 cm)5 min,弃去上清液,加Hank's液重复洗涤2次,收集脾细胞,加入RPMI1640培养液混悬,用血球计数板调细胞浓度至5×106·mL-1。将脾细胞悬液加入96孔培养板中,每孔100 μL,同时每孔加入刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA,终浓度为4 μg·mL-1) 100 μL,并设不加ConA的孔,均设3个复孔,置37℃、5%CO2中培养72 h,加入2 mg·mL-1MTT50 μL,继续培养4 h,离心弃上清液,每孔加入酸性二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL。振荡,于室温暗处放置15 min,酶标仪于波长578 nm测定吸光度(A)值,计算细胞增殖活性。增殖活性=加ConAA值/无ConAA值[4]。

1.9 平板计数法测定各组小鼠肝、肾组织活菌数目无菌取出各组小鼠肝脏、肾脏,加入Hank's液研磨,稀释1 000倍,取1 mL加入沙氏培养液,于37℃培养箱中培养48 h。每份脏器设3块平板。脏器总活菌数/mL=同一脏器3个平板中菌落平均数×稀释倍数。

1.10 统计学方法 采用SPSS17.0版统计软件进行统计学分析,各组样本均数组间比较采用单因素方差分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对系统性白念珠菌感染小鼠存活率的影响 见图1。模型对照组小鼠于第8天全部死亡。艾叶发酵物小剂量组于第13天全部死亡,而艾叶发酵物中、大剂量组第21天存活率仍可达20%和40%。阳性对照组第21天存活率为30%。

2.2 对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性的影响 见图2。与模型对照组比较,艾叶发酵物小、中、大剂量组和阳性对照组T淋巴细胞增殖活性增强(P＜0.05,P＜0.01)。

2.3 ELISA法测定各组小鼠血清中IFN-γ、IL-2水平 见表1。与模型对照组比较,艾叶发酵物小剂量组血清IFN-γ水平差异无统计学意义,IL-2水平显著升高(P＜0.05);艾叶发酵物中、大剂量组和阳性对照组血清IFN-γ、IL-2水平显著提高(P＜0.01)。

图1 5组小鼠存活率实验结果Fig.1 Results of survival ratio in five groups of mice

与模型对照组比较*1P＜0.05,*2P＜0.01图2 5组小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性实验结果Compared with the model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05Fig.2 Proliferation activity of splenic T lymphocyte in five groups of mice

2.4 5组小鼠肝肾组织活菌数 见表2。与模型对照组比较,艾叶发酵物小剂量组肝、肾组织活菌数量差异无统计学意义,艾叶发酵物中、大剂量组和阳性对照组肝、肾组织活菌数量显著降低(P＜0.01)。

3 讨论

中药发酵是以中药为反应底物,通过微生物发酵过程对其结构进行修饰、转化从而达到提高中药药效、降低毒性、促进吸收、改善口味等目的[5-6]。目前该技术已成为一种新型的中药研究技术,并取得了一定的成果。本研究以艾叶为反应底物,通过酵母菌发酵过程对艾叶中成分进行修饰,以期得到更有效的抗白念珠菌治疗药物。

表1 5组小鼠血清IFN-γ与IL-2水平测定结果Tab.1 Serum levels of IFN-γ and IL-2 in five groups of mice ±s,n=8

表1 5组小鼠血清IFN-γ与IL-2水平测定结果Tab.1 Serum levels of IFN-γ and IL-2 in five groups of mice ±s,n=8

与模型对照组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01;与艾叶发酵物小剂量组比较,*3P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01; Compared with Artemisia argyi ferment substance group,*3P＜0.05

组别剂量/ (mg·kg-1) IFN-γ/ (ng·L-1) IL-2/ (μg·L-1)模型对照组…136.56±26.595.23±0.61艾叶发酵物组小剂量组100147.28±31.646.12±0.95*1中剂量组200156.25±34.26*211.56±1.59*2*3大剂量组400164.23±32.55*2*315.52±2.65*2*3阳性对照组20149.53±33.11*214.26±2.49*2*3

表2 5组小鼠肝与肾组织活菌数测定结果Tab.2 Viable count of liver and kidney tissues in five groups of mice x±s,n=8

本研究通过注射环磷酰胺造成小鼠免疫功能低下,再尾静脉注射白念珠菌,建立系统性白念珠菌小鼠模型。结果显示,模型对照组小鼠在给药后第8天已全部死亡,而艾叶发酵物组中、大剂量组和阳性对照组可明显提高模型小鼠生存率。模型对照组小鼠肝脏、肾脏白念珠菌活菌数量也明显高于艾叶发酵物中、大剂量组和阳性对照组。提示艾叶发酵物中、大剂量对系统性白念珠菌感染具有一定治疗作用。

既往研究表明,CD+4亚群(Th细胞),主要是Th1细胞在宿主与白念珠菌的相互作用过程中具有重要的调节作用[7],Th1细胞有利于机体对真菌感染的免疫防护。而Th1细胞所发挥的大部分效应是通过其所分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ等来实现的。IL-2和IFN-γ不仅能增强巨噬细胞的杀菌活性,而且能使静止的T细胞向Th1细胞分化,活化,介导细胞免疫应答[8]。实验结果显示,与模型对照组比较,艾叶发酵物不同剂量组可明显增强T淋巴细胞增殖活性,其血清中IL-2、IFN-γ含量也显著增高。提示艾叶发酵物可能通过提高T淋巴细胞增殖活性,及增加体内IL-2、IFN-γ的含量来发挥抗白念珠菌作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.010

Therapeutic Effects of Artemisia Argyi Ferment Substance on Systemic Candida Albicans Infection

BAI Jing1,HU Lei1,ZHANG Li2,TIAN Chun-yu1,PANG De-quan1,BO Hai-mei1,HAN Shu-ying1
(1. Department of Pharmacology,School of Basic Medicine,Hebei United University,Tangshan 063000,China;2.Department of Anesthesiology,Tangshan Gongren Hospital,Hebei Province,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects and mechanism ofArtemisia argyiferment substance on systemicCandida albicansinfection.MethodsThe model of systemicCandida albicansinfection was established in immunosuppressed mice.The model mice were randomly divided into the model control,Artemisia argyiferment substance(AAFS) at different doses(100,200,and 400 mg·kg-1)and fluconazole group(20 mg·kg-1),30 mice in each.Mice in each treatment group were given therapeutic drugs by gavage for 5 consecutive days,twice daily.The survival of mice was determined 21 days after the model was set up.The serum levels of IFN-γ and IL-2 were determined by ELISA.The proliferation activity of T lymphocyte in the spleen was detected by MTT assay.The number of living fungi in liver and kidney tissues was counted.ResultsCompared with the model control,AAFS at middle and high doses and fluconazole significantly increased the survival rate of mice,the serum levels of IFN-γ and IL-2,and the proliferation activity of T lymphocyte in the spleen,but decreased the number of living fungi in tissues(P＜0.01).Compared with low dose AAFS,middle and high doses of AAFS and fluconazole showed significantly different effect on each index(P＜0.05 orP＜0.01),but there was no difference among these groups(P>0.05).ConclusionAAFS at 200-400 mg·kg-1has inhibitory effects on systemicCandida albicansinfection in mice,the mechanism of which is related to increasing the proliferation of T lymphocyte in spleen and the levels of IFN-γ and IL-2 in serum.

Artemisia argyiferment substance;Infection,candida albicans

R286;R965

A

1004-0781(2014)11-1438-04

2013-11-06

2013-12-11

*唐山市科技计划项目(12130208A-2)

白静(1978-),女,辽宁葫芦岛人,副教授,硕士,主要研究方向:中药药理。电话:0315-3725870,E-mail:13513259511@sina.com。

韩淑英(1959-),女,内蒙古通辽人,教授,硕士,主要研究方向:中药药理。电话:0315-3725870,E-mail:shuyinghan59@163.com。