高效液相色谱法同时测定补肾化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量*

欧阳露,夏勇,夏鹏,李洪亮,汪选斌

(1.湖北医药学院附属人民医院中药药理实验室,十堰 442000；2.湖北医药学院药学院,十堰 442000)

高效液相色谱法同时测定补肾化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量*

欧阳露1,2,夏勇2,夏鹏2,李洪亮1,2,汪选斌1,2

(1.湖北医药学院附属人民医院中药药理实验室,十堰 442000；2.湖北医药学院药学院,十堰 442000)

目的 建立高效液相色谱法同时测定补肾化瘀浸膏中淫羊藿苷及柚皮苷含量。方法C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm),以乙腈-磷酸溶液(0.2%磷酸,pH=2.9)为流动相,梯度洗脱,流速0.8 mL·min-1,检测波长269 nm,柱温30℃。结果淫羊藿苷在0.3～3.0 μg范围内线性关系良好(r=0.999 9),加样回收率105.6%,RSD为0.95%;柚皮苷在0.12～1.20 μg范围内线性关系良好(r=0.999 9),加样回收率94.0%,RSD为0.52%。结论该方法操作简便,准确稳定,重复性好,可作为补肾化瘀浸膏的质量控制标准。

补肾化瘀浸膏;柚皮苷;淫羊藿苷;色谱法,高效液相

补肾化瘀浸膏由淫羊藿(Epimedium brevicornumMaxim.)、骨碎补[Drynaria fortune(Kunze)J.Sm]等药材组方制成,实验研究证实,该方具有补肾壮骨、活血镇痛之功效,对原发性骨质疏松症有良好的治疗作用,具有很高的临床应用和开发价值[1-2]。为了保证该制剂在临床应用安全有效,笔者参考相关文献[3-4],建立了高效液相色谱(HPLC)法同时测定制剂中淫羊藿苷和柚皮苷含量的方法,为有效控制补肾化瘀浸膏的质量提供参考标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SHIMADZU LC-20系列高效液相色谱仪:工作站LC solution,LC-20AD泵,SIL-20A自动进样器, SPD-M20A检测器。分析天平(FA2004型,上海天平仪器厂)。超声波清洗机(KQ3200型,昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 补肾化瘀浸膏(湖北医药学院附属人民医院提供,批号:20130226,20130311,20130319),淫羊藿苷、柚皮苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号分别为200415,201111),甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯),流动相用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适应性实验 色谱柱C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；梯度洗脱,流动相:磷酸溶液(0.2%磷酸,pH=2.9)-乙腈(0～13 min,体积分数为77%,～20 min,体积分数为67%,～35 min,体积分数为77%),检测波长269 nm；流速0.8 mL·min-1；柱温30℃；进样量10 μL。各峰的理论板数不低于5 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取淫羊藿苷及柚皮苷对照品适量,精密称定,加甲醇分别制成每毫升含淫羊藿苷约0.3 mg和柚皮苷0.12 mg的溶液,摇匀即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取补肾化瘀浸膏约10 g,精密称定,置于100 mL锥形瓶中,精密加入甲醇100 mL,精密称定质量,超声提取30 min,静置放冷至室温,以甲醇补足损失质量,滤过,续滤液用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方和工艺制法分别制备不含淫羊藿和骨碎补的阴性样品,再按“2.2.2”项下方法制得阴性样品溶液。

2.3 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下制备的对照品溶液适量,加甲醇稀释成每毫升含柚皮苷分别约为0.012,0.024,0.036,0.048,0.120 mg,含淫羊藿苷分别约为0.03,0.06,0.09,0.12,0.30 mg对照品系列溶液,各自精密吸取10 μL,注入液相色谱仪,以质量浓度对峰面积进行线性回归,得各组分的线性范围和回归方程,柚皮苷在进样量0.12～1.20 μg范围内线性关系良好,回归方程:Y=620 247.6X+0.479,r= 0.999 9；淫羊藿苷在进样量0.3～3.0 μg范围内线性关系良好,回归方程:Y=402 191.2X-3.188,r= 0.999 9。

2.4 精密度实验 按照“2.2.2”项下方法制备样品溶液,按照“2.1”项色谱条件下进样10 μL,重复6次,以淫羊藿苷和柚皮苷峰面积计算RSD,其结果分别为0.07%和0.03%,说明仪器精密度良好。

2.5 重复性实验 取同一批补肾化瘀浸膏(批号: 20130226),按照“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液,按照“2.1”项色谱条件进样10 μL,计算淫羊藿苷和柚皮苷含量的RSD分别为0.07%和1.62%,说明该法重复性好。

2.6 稳定性实验 取同一样品溶液(批号: 20130226),按照“2.1”项色谱条件分别在0,1,2,4,8, 12 h进样10 μL,测定峰面积,计算淫羊藿苷和柚皮苷峰面积的RSD均为0.21%。表明样品溶液在12 h内稳定性良好,可满足测定要求。

2.7 加样回收率实验 取已知淫羊藿苷和柚皮苷含量的补肾化瘀浸膏6份各约10 g,精密称定,置100 mL量瓶中,精密加入淫羊藿苷、柚皮苷对照品甲醇溶液适量,按“2.2.2”项下方法制备样品溶液,按照“2.1”项色谱条件测定含量,求得淫羊藿苷和柚皮苷的平均回收率分别为105.6%,94.0%,RSD分别为0.95%, 0.52%。见表1。

表1 淫羊藿苷和柚皮苷加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery test of naringin and icariin

2.8 专属性考察 取“2.2.1”项对照品溶液,“2.2.2”项供试品溶液和“2.2.3”项两种阴性样品溶液,分别按“2.1”项下色谱条件进样10 μL,记录色谱图。结果,阴性样品溶液在相应对照品溶液出峰处无吸收峰,表明其他组分对淫羊藿苷和柚皮苷的含量测定无影响。见图1。

2.9 样品含量测定 取3批样品,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件进样10 μL,计算含量,结果见表2。

3 讨论

淫羊藿和骨碎补均为补肾化瘀浸膏组方中主药,研究证实,淫羊藿和骨碎补中的黄酮类是其主要化学成分和有效成分,具有明确抗骨质疏松的药理作用,淫羊藿苷和柚皮苷则分别是两种药材中主要黄酮类成分[5-6],因此选择检测淫羊藿苷和柚皮苷的含量作为补肾化瘀浸膏的质量控制指标。

A.骨碎补阴性对照品;B.淫羊藿阴性对照品;C.对照品;D.供试品;1.淫羊藿苷;2.柚皮苷图1 4种溶液的HPLC色谱图A.Negative control of Drynaria fortune(Kunze)J.Sm；B.negative control of Epimedium brevicornum Maxim；C.control；D.sample；1.naringin；2.icariinFig.1 HPLC chromatography of four kinds of solution

表2 3批样品中柚皮苷和淫羊藿苷含量测定结果Tab.2 Result of content determination of icariin and naringin on three samples n=3

为了使淫羊藿苷和柚皮苷能够良好地分离,本实验对色谱条件进行了考察。结果表明,以乙腈-醋酸铵水溶液为流动相(27∶73)时,二者能够达到较好的分离,但淫羊藿苷峰附近出现干扰峰,更换流动相为乙腈-磷酸水溶液,且采用梯度洗脱,不仅能使二者有效分离,还能消除杂质对被测成分的干扰,同时节省了时间和溶剂。淫羊藿苷和柚皮苷的最大吸收波长分别为270和285 nm,本实验考察发现在269 nm单一波长下,淫羊藿苷和柚皮时能同时得到较好的色谱峰,因此选择269 nm作为检测波长。

笔者建立的含量测定方法,操作简便,准确稳定,重复性好,可作为补肾化瘀浸膏的质量控制标准。

[1] 欧阳露,汪选斌,国宏莉,等.补肾化瘀浸膏对去势大鼠骨密度及骨组织形态的影响[J].医药导报,2009,28(12): 1533-1535.

[2] 欧阳露,汪选斌,肖雨清,等.补肾化瘀浸膏对去势大鼠血清ALP、E2及IL-6水平的影响[J].中国药师,2009,12 (10):1342-1344.

[3] 万婷,熊富良,高文天,等.骨康胶囊的质量控制研究[J].中成药,2012,34(6):1096-1099.

[4] 韩丽萍,陈行愉,刘志刚.HPLC法同时测定抗骨质疏松中成药中柚皮苷及淫羊藿苷的含量[J].中国药房,2010,21 (43):4083-4085.

[5] PEI L K,SUN S Q,GUO B L,et al.Fast quality control of HerbaEpimediibyusingFouriertransforminfrared specroscopy[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2008,70(2):258-264.

[6] 彭双,韩立峰,王涛,等.骨碎补中的化学成分及药理作用研究进展[J].天津中医药大学学报,2012,31(2):122-125.

DOI 10.3870/yydb.2014.09.032

Simultaneous Determination of Icariin and Naringin in Bushen Huayu Extract by HPLC

OUYANG Lu1,2,XIA Yong2,XIA Peng2,LI Hong-liang1,2,WANG Xuan-bin1,2
(1.Laboratory of Chinese Herbal Pharmacology,Affiliated People’s Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;2.School of Pharmacy,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

Objective To establish a method for simultaneous determination of icariin and naringin content inbushen huayuextract by HPLC.MethodsReverse-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC)separation was performed one C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase was acetonitrile containing 0.2%H3PO4(pH=2.9). Gradient elution with a flow rate of 0.8 mL·min-1was applied to achieve the separation.The detection wavelength was set at 269 nm,and the column temperature was 30℃.ResultsIcariin had a good linear range from 0.3-3.0 μg(r=0.999 9). The recovery rate was 105.6%,and RSD was 0.95%.Naringin was linear within the range of 0.12-1.20 μg(r=0.999 9).The recovery rate was 94.0%and RSD was 0.52%.ConclusionThe method is simple,stable,accurate,and reproducible,which can be used as the quality control standard forbushen huayueextract.

Bushen huayuextract;Icariin;Naringin;Chromatography,high performance liquid

R286；R927.2

B

1004-0781(2014)09-1224-03

2013-07-10

2013-10-30

*十堰市科学技术研究与开发项目(ZD2011023)；湖北省教育厅项目(B20082412)；湖北省2011协同创新中心基金资助项目(4)

欧阳露(1972-),女,湖北监利人,副主任药师,副教授,硕士,研究方向:中药新制剂研发。电话:0719-8637260,E-mail:ouyanglu-sy@163.com。

汪选斌(1971-),男,湖北十堰人,主任药师,教授,博士,研究方向:中药药理。电话:0719-8843185,E-mail: xuanbin.w@163.com。