利鲁唑片在犬体内的药动学及体内外相关性研究

慕金超,刘春芬

(徐州工业职业技术学院,徐州 221140)

利鲁唑片在犬体内的药动学及体内外相关性研究

慕金超,刘春芬

(徐州工业职业技术学院,徐州 221140)

目的 研究利鲁唑片(受试制剂)与利鲁唑胶囊(参比制剂)在比格犬体内药动学参数及利鲁唑片体外释放与体内吸收的相关性,计算利鲁唑片的相对生物利用度。方法健康比格犬6只,分别灌服相当于利鲁唑50 mg的利鲁唑片和市售利鲁唑胶囊,服药后及间隔14 d交叉服药后0～72 h内静脉取血。用高效液相色谱法测定血浆中利鲁唑浓度,房室模型计算其主要的药动学参数,用Wanger-Nelson法对利鲁唑片在犬体内外相关性进行评价。结果受试制剂与参比制剂的半衰期(t1/2)分别为(12.43±3.87)和(12.57±3.25)h,达峰时间(tmax)分别为(6.00±2.60)和(6.23± 2.72)h,峰浓度(Cmax)分别为(56.24±16.51)和(60.82±18.13)ng·mL-1,浓度-时间曲线下面积(AUC0-72)分别为(1 255.83±311.39)和(1 283.50±313.81)ng·mL-1·h,AUC0-∞分别为(1 282.57±322.64)和(1 297.22±297.39) ng·mL-1·h。胶囊剂对片剂的相对生物利用度为(105.9±30.6)%。结论HPLC法测定血中利鲁唑浓度,杂质无干扰,重复性好,准确度高。利鲁唑片在犬体内吸收度与参比制剂相当。利鲁唑片体内外相关性良好。

利鲁唑;药动学;色谱法,高效液相

利鲁唑片主要用于肌萎缩侧索硬化症患者的治疗,可延长生存期和延缓呼吸功能障碍的发生[1]。笔者建立测定血中利鲁唑浓度的高效液相色谱(HPLC)法,并采用该法考察利鲁唑片(受试制剂)与利鲁唑胶囊(参比制剂)在比格犬体内利鲁唑的相对生物利用度与药动学特性,为该制剂临床应用提供参考。采用Wanger-Nelson法对利鲁唑片在比格犬的体内外相关性进行评价。

1 材料与方法

1.1 动物 健康比格犬6只,雌雄各半,体质量10～12 kg,由扬州大学比格犬饲养基地提供,饲养于徐州医学院实验中心实验动物房,实验动物生产许可证号: SCXK(苏)2010-0003,实验动物质量合格证号: 20200601。实验前禁食12 h。

1.2 药品与试剂 利鲁唑片(江苏恩华药业股份有限公司,批号:20120119,每片含利鲁唑50 mg)；利鲁唑胶囊(山东鲁南贝特制药有限公司,批号:120307,每粒含利鲁唑50 mg)；利鲁唑对照品(鲁南制药股份有限公司,批号:120318,标示量99.8%)；盐酸氟西汀对照品(江苏恩华药业股份有限公司技术中心合成室精制,批号:20120125,标示量99.8%)；乙腈(色谱纯,上海凌峰化学试剂有限公司),甲醇(色谱纯,上海凌峰化学试剂有限公司)、乙酸铵(色谱纯,TEDIA公司)；磷酸(分析纯,无锡亚盛化工有限公司)；正己烷(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司)。

1.3 实验仪器 Agilent1100型高效液相色谱仪(美国安捷仑公司,G1321荧光检测器,G1310色谱泵)；HS色谱数据工作站(杭州英谱科技开发有限公司)；METTLERAG135双量程电子天平(瑞士梅特勒有限公司)；TGir16B离心机(上海安亭科学仪器厂)；XW 80型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；pHS-4C型酸度计(成都市方舟科技开发公司)。

1.4 实验设计与血样采集 采用双周期自身对照交叉实验,将6只健康比格犬随机分为A、B两组,每组3只。两组比格犬禁食12 h(自由饮水)后,分别灌服利鲁唑片1片(每片按利鲁唑计50 mg)或利鲁唑胶囊1粒(每粒按利鲁唑计50 mg),给药后0,1,2,3,4,5,6, 7,8,10,12,16,24,48,72 h静脉采血,间隔14 d后交叉服药,同样时间点静脉采血。所采血样用肝素抗凝,离心得血浆后,于-20℃冰箱保存。

1.5 血浆样品浓度测定方法

1.5.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil BDSC18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相:0.03 mol·L-1乙酸铵溶液(用磷酸调pH至3.5)-甲醇-乙腈(38∶20∶42)；流速:1 mL·min-1；荧光激发波长:232 nm；荧光发射波长:350 nm；进样量:20 μL；柱温:35℃[2-3]。

1.5.2 溶液的制备 取利鲁唑对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并分别制成每毫升含利鲁唑0.01, 0.02,0.05,0.10,0.25,0.50,1.00,2.00 μg的溶液,作为对照品溶液。

取盐酸氟西汀适量,精密称定,加甲醇溶解并制成每毫升含盐酸氟西汀约1.0 μg的溶液,作为内标溶液。

1.5.3 血浆样品的处理 取血浆样品1.0 mL,加入内标溶液10 μL和2.0 mol·L-1氢氧化钠溶液0.1 mL,混匀,加正己烷3 mL,涡旋振荡1 min, 3 000 r·min-1离心2 min,取有机层,于40℃水浴中用氮气吹干,残渣用流动相100 μL溶解,于3 000 r·min-1离心10 min,取上清液20 μL注入色谱仪。

1.5.4 专属性实验 取空白血浆,除不加入内标溶液外,其他按“1.5.2”项下操作。另取加入利鲁唑对照品的血浆、灌服受试药后6 h后的血浆各按“1.5.3”项下操作。验证方法的专属性。

1.5.5 线性范围与检测限 精密量取不同浓度的对照品溶液各100 μL,再加入空白血浆900 μL,配成浓度分别为每毫升含利鲁唑1.0,2.0,5.0,10.0,21.0, 50.0,100.0,250.0 ng系列加标血样,按“1.5.3”项下操作。以对照品的峰面积(AR)与内标的峰面积(AS)的比值(f=AR/AS)对浓度(C)作直线回归。

1.5.6 回收率实验 提取回收率实验:取空白血浆900 μL,按“1.5.5”项下方法分别配制低、中、高3种浓度(分别为2.0,50.0,200.0 ng·mL-1)的血浆样品,每种浓度做5份样品。除不加入内标溶液外,其他按“1.5.3”项下操作,记录对照品峰面积,与相应浓度的对照品溶液直接进样所得峰面积相比,即得。相对回收率实验:取空白血浆900 μL,按“1.5.5”项下方法分别配制低、中、高3种浓度(分别为2.0,50.0, 200.0 ng·mL-1)的血浆样品,每种浓度做5份样品,按“1.5.3”项下操作,记录对照品的峰面积(AR)与内标的峰面积(A)的比值(f),代入利鲁唑标准曲线计算测得浓度,与实际加入对照溶液浓度相比,即得。

1.5.7 精密度实验 照“1.5.2”项下方法制备血浆样品,同法操作,记录对照品和内标峰面积比值(f),日内重复测定5次,日间重复测定5 d。以考察日内变异和5 d内的日间变异。

1.5.8 冻融稳定性实验 取空白血浆900 μL,按“1.5.5”项下方法分别配制低、中、高3种浓度(分别为2.0,50.0,200.0 ng·mL-1)的血浆样品,每种浓度做5份样品,每种浓度样品先测1份,其余放置-20℃冰箱冷藏,在1周内分4次测定。测定时于37℃水浴融解后,按“1.5.3”项下操作,测定血浆中利鲁唑的峰面积。如此反复4次冻融。

1.6 数据处理与统计学方法 本实验采用房室模型和统计矩模型来计算其主要的药动学参数:血药峰浓度(Cmax)、达峰时间(tmax)、药物浓度-时间曲线下面积(AUC)、平均驻留时间(mean retention time,MRT)及相对生物利用度等。利鲁唑片和利鲁唑胶囊各项药动学参数均由DAS2.0版软件进行计算,将所得单剂量给药的Cmax、AUC0-∞、AUC0-T经对数转换后进行方差分析,并进一步采用双单侧t检验和90%置信区间法进行生物等效性评价。tmax经非参数检验法(秩和检验)进行差别检验[4],以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆样品浓度测定

2.1.1 专属性实验 空白血浆、加入对照物的血浆(对照品)、灌服受试药后6 h后的血浆(样品)色谱图见图1。图1表明,在本实验条件下,血浆中内源性物质不干扰样品峰的测定,基线噪音小,利鲁唑、内标的出峰时间依次为9.0与11.0 min,峰形尖锐,分离度好。表明本法具有良好的专属性,在此条件下所测得的结果能准确反映利鲁唑浓度。

2.1.2 线性范围与检测限 以对照品的峰面积(AR)与内标的峰面积(AS)的比值(f=AR/AS)对浓度(C)作直线回归,得回归方程:f=0.011 3C+0.004 82,r= 0.998 9。实验表明,本方法的线性范围为1.0～250.0 ng·mL-1。按上述条件测得利鲁唑最低检测限为0.3 ng·mL-1(以信噪比＞3计),定量限为1.0 ng·mL-1(以信噪比＞10计),RSD为4.6%。

2.1.3 回收率实验

2.1.3.1 提取回收率实验 记录对照品峰面积,与相应浓度的对照品溶液直接进样所得峰面积相比,结果低、中、高浓度(分别为2.0,50.0,200.0 ng·mL-1)血浆样品的平均提取回收率(n=5)分别为(104.4± 4.5)%,(93.2±9.7)%,(96.9±3.1)%,RSD分别为4.3%,10.4%与3.2%。

2.1.3.2 相对回收率实验 记录对照品的峰面积(AR)与内标的峰面积(AS)的比值(f),代入利鲁唑标准曲线计算测得浓度,与实际加入对照溶液浓度相比,即得低、中、高3种浓度血浆样品的平均相对回收率(n=5)分别为(101.0±9.6)%,(105.0±11.2)%,(97.1± 3.1)%,RSD分别为9.5%,10.7%与3.2%。

2.1.4 精密度实验 低、中、高浓度的血浆样品日内RSD(n=5)分别为4.7%,4.2%,3.8%；日间RSD(n= 5)分别为6.6%,1.4%,6.2%。

2.1.5 冻融稳定性实验 低、中、高浓度的血浆样品RSD分别为1.2%,1.8%,6.1%,比较4次冻融的峰面积与冻融前峰面积,RSD＜10%,符合生物样品分析要求。表明样品在4次冻融过程中稳定。

2.2 血药浓度-时间曲线 6只比格犬单剂量给药,利鲁唑片和利鲁唑胶囊的平均血药浓度-时间曲线见图2A和图2B,曲线满足一室模型,权重系数为1/C2。

A.空白血浆;B.对照品;C.样品;1.利鲁唑;2.内标图1 3种血浆的HPLC图A.blank plasma；B.reference substance；C.sample；1 riluzole；2.internal standardFig.1 HPLC chromatogram of three kinds of plasma samples

A.利鲁唑片;B.利鲁唑胶囊图2 两种样品的平均血药浓度-时间曲线A.riluzole tablets；B.riluzole capsulesFig.2 Mean plasma concentration-time curve of two kinds of samples

2.3 数据处理 采用DAS2.0版软件对数据进行药动学模型拟合,利鲁唑片和利鲁唑胶囊血的药浓度数据符合一室开放模型,房室模型参数见表1。利鲁唑胶囊对利鲁唑片的相对生物利用度(105.9±30.6)%。

目前大多采用AUC和Cmax经对数转换后以多因素方差分析进行显著性检验,然后用双单侧t检验和计算90%置信区间的统计分析方法来评价和判断药物间的生物等效性。经对数转换后的受试制剂的AUC在参比制剂的80%～125%范围内,受试制剂的Cmax在参比制剂的75%～133%范围内,对于tmax,经非参数法检验差异无统计学意义,可判断两药生物等效[5]。

单次灌服相当于5 mg·kg-1利鲁唑的利鲁唑片和市售利鲁唑胶囊后,AUC0-∞的几何均值分别为1 282.57和1 297.22 ng·mL-1·h,比率为0.99,90%可信限为(0.82,1.15),在0.80～1.25等效范围内；Cmax的几何均值分别为56.24和60.82 ng·mL-1,比率为0.92,90%可信限为(0.78,1.09),在0.75～1.33等效范围内；tmax的几何均值是6.00和6.23 h,比率为0.96,90%可信限为(0.82,1.14)在0.80～1.25等效范围内[6-7]。

结果表明,利鲁唑片和利鲁唑胶囊在比格犬内初步具有生物等效性,还需做这两种制剂在大量动物或人体内的实验等进一步来验证其生物等效性。

2.4 体内外相关性研究 按照《中华人民共和国药典》(2010年版)二部中要求进行体内外相关性的试验,“只有当体内外具有相关性,才能通过体外释放曲线预测体内情况”。因此,为评价自制利鲁唑片的体外释放条件的合理性,笔者研究了利鲁唑片体外释放与体内吸收的相关性。

由犬体内释放研究结果可知,比格犬单剂量服用利鲁唑片后,利鲁唑在体内的吸收符合一室模型,因此选用Wanger-Nelson法计算利鲁唑片在比格犬体内不同时间点的吸收分数[8-9],公式为:

其中Ct为t时间的血药浓度；Ke为消除速度常数, AUC用梯形面积法计算。计算结果见表2。

由利鲁唑片在比格犬体内的血药浓度-时间曲线及以上的体内吸收分数表明,利鲁唑片6～7 h达到峰浓度,以8 h前的血药浓度-时间作为吸收相,以利鲁唑片体外累积释放度结果进行考察,结果见表3。

表1 比格犬单剂量给予利鲁唑片和利鲁唑胶囊经时血药浓度数据模型拟合参数Tab.1 Fitting parameters of plasma concentration-time data after a single dose of riluzole tablets or riluzole capsules in Beagle dogs ±s

表1 比格犬单剂量给予利鲁唑片和利鲁唑胶囊经时血药浓度数据模型拟合参数Tab.1 Fitting parameters of plasma concentration-time data after a single dose of riluzole tablets or riluzole capsules in Beagle dogs ±s

制剂t1/2/ h AUC0-72AUC0-∞(ng·mL-1·h) MRT0-72tmaxhCmax/ (ng·mL-1)利鲁唑胶囊12.57±3.251 283.50±313.81 1 297.22±297.3921.47±6.136.23±2.7260.82±18.13利鲁唑片12.43±3.871 255.83±311.39 1 282.57±322.6420.42±5.056.00±2.6056.24±16.51

表2 利鲁唑片在比格犬体内不同时间点的吸收分数Tab.2 Absorption rate of riluzole tablets in Beagle dogs at different time points

表3 利鲁唑片体内吸收分数与对应时间点的体外释放度Tab.3 In vivo absorption rate and in vitro release rate at the corresponding time points %

以体内吸收分数Y对体外释放度X进行线性回归,方程为:Y=0.777X+8.260,r=0.963。

根据《中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录要求,查得临界相关系数为0.951(P＜0.01,自由度f为5)。本品相关系数(0.963)大于临界相关系数(P＜0.01),表明利鲁唑片体内外相关良好。

3 讨论

笔者尚未见国内文献报道血中利鲁唑浓度的测定方法,国外报道过采用紫外检测的HPLC法和液相色谱-质谱联用技术的检测法[10]。笔者在本实验建立了灵敏、重复性好、准确度高的血中利鲁唑浓度的HPLC法,测定了6只健康比格犬单剂量服用利鲁唑参比制剂与受试制剂50 mg后利鲁唑血浆浓度。tmax、Cmax、AUC0-72、AUC0-∞经多因素方差分析,这两种制剂给药周期间和药物间均差异无统计学意义(P＞0.05),两者具有生物等效性。

利鲁唑片在犬体内吸收程度与参比制剂相当,体内外相关性良好,表明利鲁唑片和胶囊剂都是理想的制剂类型。

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DOI 10.3870/yydb.2014.09.008

Study on Pharmacokinetics and in Vitro-in Vivo Correlation of Riluzole Tablets in Dogs

MU Jin-chao,LIU Chun-fen
(Xuzhou College of Industrial Technolegy,Xuzhou 221140,China)

Objective To study the pharmacokinetic parameters of riluzole tablets and commercial riluzole capsules in Beagle dogs,and evaluate the correlation between the release ratein vitroand the absorptionin vivo,and calculate the relative bioavailability of riluzole tablets.MethodsSix Beagle dogs were treated with 50 mg of riluzole tablets or capsules,and then cross-treated by the other drug after 14-days wash out period.Blood concentration of riluzole was measured by high performance liquid chromatography(HPLC).The atrioventricular model was used to calculate the pharmacokinetic parameters and Wanger-Nelson method was applied to assess the correlation between the release ratein vitroand the absorptionin vivo.ResultsThet1/2,tmax,Cmax,AUC0-72and AUC0-∞in the tablet and capsule groups were(12.43±3.87)and(12.57±3.25)h,(6.00±2.60)and (6.23±2.72)h,(56.24±16.51)and(60.82±18.13)ng·mL-1,(1 255.83±311.39)and(1 283.50±313.81)ng·mL-1·h, (1 282.57±322.64)and(1 297.22±297.39)ng·mL-1·h,respectively.The relative bioavailability of capsules versus tablets was (105.9±30.6)%.ConclusionHPLC method can be applied to measure the concentration of blood riluzole with little interference and high levels of repeatability and accuracy.The absorption in Beagle dogs between riluzole tablets and capsules was equal,and a good correlation between thein vivoabsorption andin vitrorelease has been found in this study.

Riluzole;Pharmacokinetics;Chromatography,high performance liquid

R971；R965

A

1004-0781(2014)09-1149-05

2013-08-07

2013-11-22

慕金超(1978-),男,安徽蒙城人,讲师,高级技师,硕士,研究方向:药学和食品营养。电话:(0)13813465389, E-mail:mujc@mail.xzcit.cn。

刘春芬(1978-),女,天津人,讲师,硕士,研究方向:食品微生物与发酵工程。电话:(0)15205201886,E-mail:liucf@mail.xzcit.cn。