姜辣素对小鼠B16细胞黑素合成的影响*

神芳丽,霍仕霞

(1.新疆银朵兰维药股份有限公司,乌鲁木齐 830049;2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所,新疆维吾尔医方剂学实验室,乌鲁木齐 830049)

姜辣素对小鼠B16细胞黑素合成的影响*

神芳丽1,霍仕霞2

(1.新疆银朵兰维药股份有限公司,乌鲁木齐 830049;2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所,新疆维吾尔医方剂学实验室,乌鲁木齐 830049)

目的 探讨姜辣素对小鼠B16细胞黑素合成的影响。方法黑素瘤细胞分别加入12.5,25.0,50.0, 100.0,200.0 μmol·L-1姜辣素和阳性对照药物氢醌培养,达尔伯克改良伊格尔培养液(DMEM)作为空白对照组。采用四噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖,比色法测定酪氨酸酶活性和黑素含量。结果与空白对照组比较,含姜辣素的给药组均能够明显抑制小鼠B16细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01),且浓度为200.0 μmol·L-1时,抑制率＞48%。与空白对照组比较,各浓度姜辣素均能够显著降低酪氨酸酶活性(P＜0.05或P＜0.01),姜辣素的浓度为200.0 μmol·L-1时,对酪氨酸酶的活性的抑制率可达50%。与空白对照组比较,各浓度的姜辣素和氢醌均能够显著降低黑素含量(P＜0.05或P＜0.01),但不呈剂量依赖性,浓度＞25.0 μmol·L-1时,抑制黑素含量的水平基本无变化。结论姜辣素能有效抑制黑素细胞增殖和降低酪氨酸酶活性和黑素含量,从而减少黑素合成。

姜辣素;黑素瘤细胞;增殖;酪氨酸酶;黑素合成

皮肤色泽是由许多因素互相作用而造成的。皮肤色素大致分两大类,一类是自身产生的,称为内源性色素;另一类是外来的,称为外源性色素。由于遗传、代谢、内分泌、营养不良、化学剂药物、物理等因素可造成不同程度的色素沉着病,如雀斑、神经皮肤黑变病、黄褐斑等,这类疾病的治疗也是公认的难题。西药疗法存在不良反应大、易复发等缺陷,而中药治疗有其独特的优势。笔者所在课题组在研究治疗色素异常等疾病的药物中,发现姜辣素有一定的减少皮肤色素、使肤色变白的作用。本研究利用小鼠B16黑色素瘤细胞作为实验研究的受试细胞,分别考察姜辣素对细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂 姜辣素(主要含6-姜酚,由宝鸡宏远生物制药提供,批号:200911024,配制方法:以二甲亚砜溶解,超声助溶,配制成200 μmol·L-1储备液,-20℃保存备用)。氢醌(Hydroqiunone,浙江日升昌药业有限公司,批号:20111221);达尔伯克改良伊格尔培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM,美国Gibco公司,批号:2/2012);胎牛血清(美国Hyclone公司,批号:9/2012),锥虫蓝、胰酶、TrotonX-100 (scientific research special,批号:06/2012),四甲基偶氮唑盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT,America Amresco公司,批号:10/2012]。

1.2 仪器 二氧化碳培养箱(日本三洋公司,MCO-18AIC型),倒置显微镜(中国江南光电,XD-101型),微量振荡器(江苏沈高康健生化器具厂,MM-3型),酶标仪(美国伯乐公司,BIO-RAD550型),净化工作台(中国上海,YJ-875型),立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂,LDZX-75KBS型)。

1.3 细胞株 B16鼠黑素瘤细胞,购自上海中科院细胞库。

1.4 实验分组 无菌操作,用DMEM培养液分别将姜辣素和阳性对照药物氢醌配制成不同浓度的稀释液:12.5,25.0,50.0,100.0,200.0 μmol·L-1。内径0.45 μm微孔滤膜过滤后,低温、避光储存。DMEM作为空白对照,每组分别设置4个复孔。

1.5 细胞的培养 将细胞置于37℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱培养,细胞长满至培养瓶底80%时,倾去旧培养液,磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)洗涤2次,加入0.25%胰酶0.5 mL,轻轻晃动使胰酶浸润培养瓶内细胞,倒掉多余胰酶,将培养瓶放置于培养箱中,3 min后取出。在倒置显微镜下观察细胞,当细胞突起收回变圆时,立即加入适量新鲜的完全培养液,吹打为单细胞悬液,后将细胞悬液分装至新的细胞培养瓶,继续培养,一般每3～4 d传代一次,每次实验取同一代的细胞进行实验。

1.6 细胞增殖率测定 实验中选择处于对数生长期的小鼠B16黑素瘤细胞,用0.25%胰酶将其消化、吹散,收集并用培养液稀释细胞浓度为2×104个·mL-1,每孔100 μL,接种于96孔培养板,继续培养。观察待细胞贴壁后吸去培养液,分别加入含姜辣素和氢醌的培养液200 μL,同时设置空白对照孔,加入空白培养液,培养48 h后,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,继续培养4 h后弃去上清液,每孔加入二甲亚砜溶液150 μL,震荡10 min后,于490 nm波长处测定吸光度值(A值)。增殖率(%)=加药组A值/空白对照组A值×100%[1]。

1.7 细胞内酪氨酸酶活性测定 将加入含药培养液的细胞继续培养48 h后弃培养液,用PBS洗涤2次,加入1%曲拉通溶液50 μL,-80℃冻存30 min,室温下融化,37℃预热后,每孔加入0.25%左旋多巴溶液10 μL,37℃条件下反应2 h,于490 nm波长处测定A值。激活率(%)=加药组A值/空白对照组A值× 100%[2]。

1.8 黑素含量测定 将加入含药培养液的细胞培养48 h后,0.25%胰蛋白酶将其消化、吹散,收集细胞3 000 r·min-1(r=10 cm)离心10 min,用缓冲液漂洗2次后,加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液0.5 mL,于37℃下反应48 h,充分将细胞裂解,溶解黑素颗粒。于405 nm波长处测定A值。黑素含量(%)=加药组A值/空白对照组A值×100%[3]。

1.9 统计学方法 采用SPASS13.0版软件进行数据分析,测定结果以均数±标准差(±s)表示,组间采用t检验进行分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜辣素对小鼠B16黑素瘤细胞增殖的影响 与空白对照组比较,含姜辣素的给药组均能够明显抑制小鼠B16细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01),且浓度为200.0 μmol·L-1时,抑制率＞48%。结果见表1。

2.2 姜辣素对B16小鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响 与空白对照组比较,各浓度姜辣素均能够显著降低酪氨酸酶活性(P＜0.05或P＜0.01),姜辣素的浓度为200.0 μmol·L-1时,对酪氨酸酶的活性的抑制率可达50%。结果见表1。

2.3 姜辣素对B16小鼠黑素瘤细胞黑素含量的影响 与空白对照组比较,各浓度姜辣素和氢醌均能够显著降低黑素含量(P＜0.05或P＜0.01),但不呈剂量依赖性,浓度＞25.0 μmol·L-1时,抑制黑素含量的水平基本无变化。结果见表1。

3 讨论

目前,国内外研究工作者一般采用不同的黑素细胞模型进行皮肤病的研究,常用的细胞有正常人黑素细胞、黑素瘤细胞、永生化黑素细胞株等。正常培养条件下,体外培养正常黑素细胞时,细胞生长速度较为缓慢,若传代次数较多,细胞便会出现衰亡,无法提供满足实验所需要的细胞数量,因此大大限制正常黑素细胞在实验中的研究和临床上的应用。永生化黑素细胞株和鼠黑素瘤细胞系已被广泛应用于相关实验研究中,尤其是黑色瘤细胞株,因其具有产生黑素的功能,而且对实验条件要求不高,同时繁殖速度快,生长状态较为稳定;若能满足其生长所需的条件时,能够无限制的繁殖,能够充分满足实验所需,成为研究皮肤病的理想细胞。因此,本研究采用小鼠B16黑素瘤细胞株作为体外模型进行药效实验[4-5]。

表1 不同浓度的姜辣素和氢醌对B16黑素瘤小鼠细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响Tab.1 Effects of different concentration of gingerol and hydroquinone on the proliferation,tyrosinase activity and melanin content in mouse B16 melanoma cell line %,±s

表1 不同浓度的姜辣素和氢醌对B16黑素瘤小鼠细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响Tab.1 Effects of different concentration of gingerol and hydroquinone on the proliferation,tyrosinase activity and melanin content in mouse B16 melanoma cell line %,±s

与空白对照组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01Compared with the blank control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01

黑素含量空白对照组药物与浓度/ (μmol·L-1)细胞增殖率酪氨酸酶激活率100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00氢醌组12.592.76±2.11*190.51±2.69*191.13±0.32*125.087.61±2.14*288.71±2.12*285.02±2.01*250.079.12±1.96*284.32±1.45*280.75±2.21*2100.067.65±3.13*278.76±2.32*273.95±2.78*2200.059.32±1.56*262.09±1.21*265.07±1.28*2姜辣素组12.594.05±2.62*196.88±1.3993.33±1.76*125.092.90±1.07*293.58±1.82*288.15±2.30*250.084.52±1.31*282.71±2.182*282.25±0.59*2100.067.27±1.11*274.14±1.4580.15±2.98*2200.052.31±2.02*250.13±1.3180.67±2.31*2

姜辣素是姜科植物提取物之一,其主要成分有2-姜酚、4-姜酚、6-姜酚和姜烯酚等,也是姜科植物生物活性的主要成分,笔者在本实验分别考察给药后B16小鼠黑素瘤细胞的细胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量,初步从体外研究了姜辣素抑制黑素合成的作用,结果表明姜辣素能够显著抑制B16小鼠黑素瘤细胞的增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量,表明姜辣素能够有效抑制黑色素生成,从而起到美白的作用。同时,氢醌作为阳性对照药,目前广泛应用于外用治疗皮肤色素沉着,但其较强的氧化性造成皮肤永久褪色,并引起再生性障碍贫血、致癌等一系列体内毒害反应[6],而姜辣素可从许多可食用的植物中提取分离得到,毒副作用小,用于治疗皮肤色素沉着性皮肤病有很好的应用前景。

[1] 涂彩霞,张荣鑫,刘亚玲,等.18味中药乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素生成的影响[J].中国皮肤科杂志,2006,39(7):400-402.

[2] 姚莉,尚靖,徐建国.B16细胞中酪氨酸酶活性测定的方法学研究[J].新疆中医药,2007,25(4):16-18.

[3] 刘邦民,张涓,陶春蓉,等.验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞黑素合成的影响[J].时珍国医国药,2009,20(1): 209-210.

[4] 常淑彪,李永伟,许爱娥.中药对黑素细胞生物学活性影响的研究进展[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志, 2006,5(4):247-249.

[5] 杨红.人表皮黑素细胞体外培养及过氧化氢对黑素细胞影响的实验研究[D].济南:山东大学,2008:12-13.

[6] 崔霞,邹明强,胡秀丽,等.皮肤美白剂中氢醌潜在毒性研究进展[J].中国公共卫生,2008,24(7):873-874.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.009

Effects of Gingerol on Melanogenesis of B16 Melanoma Cells

SHEN Fang-li1,HUO Shi-xia2
(1.Xinjiang Yinduolan Uighur Medicine Co.,Ltd.,Urmuqi 830049,China;2. Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine,Xinjiang Laboratory of Uighur Medical Prescription,Urmuqi 830049,China)

ObjectiveTo study the effects of the gingerol on the melanogenesis in melanoma B16 cells.MethodsMelanoma cells were cultured with gingerol at 12.5,25.0,50.0,100.0,200.0 μmol·L-1and positive control drug hydroquinone,respectively,using Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM)as the blank control group.The cell proliferation was measured by methyl thiazolyltet tetrazolium(MTT)colorimetric assay.The tyrosinase activity and melanin content were measured by colorimetry assay.ResultsGingerol at different concentrations had inhibitory effect on B16 cell proliferation compared with the blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),the inhibition rate being more than 48%at the dosage of 200.0 μmol·L-1.Tyrosinase activity was inhibited significantly compared with blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),the inhibition rate being up to 50%at the dosage of 200 μmol·L-1.Melanin content was also decreased at all levels of gingerol compared with blank control group(P＜0.05 orP＜0.01),but not in a dose-dependent manner.The inhibition rate of melanin content reached the plateau at gingerol levels greater than 25.0 μmol·L-1.ConclusionGingerol can inhibit the cell proliferation,tyrosinase activity and decrease melanin synthesis in certain range of concentrations.

Gingerol;Melanoma;Proliferation;Tyrosinase;Melanin

R286;R965

A

1004-0781(2014)10-1291-03

2013-08-01

2013-10-29

*新疆维吾尔自治区青年基金项目(2012211B59)

神芳丽(1982-),女,山东淄博人,实习研究员,学士,主要从事药物分析研究。电话:(0)13369610991,E-mail:121769574@qq.com。

霍仕霞(1983-),女,四川盐亭人,助理研究员,硕士,主要从事药物分析及中药药动学研究。电话:(0) 13565889322,E-mail:huoshixia1983@163.com。