鹅不食草中槲皮素和山奈酚的含量测定

韦文芳

(南宁市第四人民医院药剂科,南宁 530023)

鹅不食草中槲皮素和山奈酚的含量测定

韦文芳

(南宁市第四人民医院药剂科,南宁 530023)

目的 建立鹅不食草药材中槲皮素、山奈酚的高效液相色谱(HPLC)含量测定方法。方法ZORBAX SBC18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相:甲醇-0.2%磷酸(45∶55),检测波长370 nm,流速0.8 mL·m in-1,柱温30℃。结果槲皮素进样量在0.089 0～1.780 0μg范围内线性关系良好(r=1.000 0),山奈酚进样量在0.071 0～1.420 0μg范围内线性关系良好(r=0.999 9),槲皮素平均加样回收率为98.94%,RSD=1.95%(n=9),山奈酚平均加样回收率为99.76%,RSD=2.35%(n=9)。结论该方法简便、易于操作,结果准确,重复性好。

鹅不食草;槲皮素;山奈酚;色谱法,高效液相;含量测定

鹅不食草为菊科植物鹅不食草[Centipeda minima(L.)A.Br.et Aschers.]的干燥全草。具有发散风寒、开鼻窍、止咳的功效,临床上主要用于治疗风寒头痛,咳嗽痰多,鼻塞不通,鼻渊流涕[1]。已知其主要成分为黄酮类、萜类、甾体类、挥发油和有机酸,还含有百里香酚类衍生物。鹅不食草中黄酮类成分主要以槲皮素衍生物的形式存在[2],也包括槲皮素和山奈酚。其药理作用主要有抗过敏、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、护肝及对心血管系统的保护等[3-5]。目前笔者尚未见鹅不食草中槲皮素和山奈酚含量测定的报道,故建立反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定其含量,报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪:Shimadzu-ProminenceHPLC(Shimadzu公司),包括LC-20A输液泵、SPDM20A二极管阵列检测器、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、LCsolution工作站;数控超声波清洗器KQ-500DB型(昆山市超声仪器有限公司);旋转蒸发仪R-1001N(郑州长城科工贸有限公司);水浴锅WB-2000(郑州长城科工贸有限公司);循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ(郑州长城科工贸有限公司);电子天平XS205DU(梅特勒-托利多公司)。0.45μm微孔滤膜。

1.2 试药 槲皮素对照品(含量＞98%,批号:110860-200406)、山奈酚对照品(含量＞98%,批号:110861-200304),均购于中国食品药品检定研究院;鹅不食草(批号:20120725,20120916,20121219),购于广西桂林,并经广西中医药大学刘寿养副教授鉴定为菊科植物鹅不食草[Centipedaminima(L.)A.Br.et Aschers.]的干燥全草。甲醇为色谱纯,乙醇、盐酸均为分析纯,水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 分别称取槲皮素对照品4.45 mg、山奈酚对照品3.55 mg,精密称定,分别加甲醇使溶解,定容在10 mL棕色量瓶中,配成浓度分别为0.445,0.355 mg·mL-1的对照品储备液。精密量取上述两种溶液各1 mL,置同一个5 m L棕色量瓶中,甲醇定容,得混合对照品溶液,混合对照品溶液中每毫升含槲皮素0.089 mg,山奈酚0.071 mg,备用。

2.2 样品溶液的制备 将干燥的鹅不食草粉碎,过筛孔内经0.425 mm(40目)筛,取鹅不食草粉末约2 g,精密称定,置150 m L锥形瓶中,加90%甲醇50 m L,超声(100 Hz)提取60 min,过滤,滤液中加入30%盐酸约15 mL,加热回流水解2 h,减压蒸干,放冷,残留物加甲醇分次溶解,定容至10 mL,经微孔滤膜滤过,得样品溶液。

2.3 色谱条件 采用ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 250 mm,5μm)为色谱柱,柱温30℃,以甲醇-0.2%磷酸(45∶55)为流动相,流速0.8 m L·min-1,检测波长370 nm。在此色谱条件下鹅不食草中槲皮素与山奈酚分离良好,理论板数按槲皮素、山奈酚峰计均＞3 500,分离度均＞1.5,槲皮素保留时间约为25 min,山奈酚保留时间约为46 min,所得图谱见图1。

2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液按上述色谱条件分别进样1,4,8,12,16,20μL,测定槲皮素、山奈酚的峰面积,以色谱峰峰面积为纵坐标(Y),样品进样量(X,μg)为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,槲皮素:Y=4.9×106X-31 777,r=0.999 9,线性范围0.089 0～1.780 0μg;山奈酚:Y=5×106X-44 018,r=0.999 9,线性范围0.071 0～1.420 0μg。结果表明,在线性范围内,槲皮素、山奈酚进样量与峰面积均呈良好线性关系。

2.5 精密度实验 取混合对照品溶液按上述色谱条件进样,连续进样6次。测得槲皮素峰面积RSD= 0.55%;山奈酚峰面积RSD=0.35%。结果表明,仪器精密度良好。

1.槲皮素;2.山奈酚图1 混合对照品(A)与样品(B)HPLC图

2.6 重复性实验 取同一批鹅不食草粉末,精密称取6份约2 g,照“2.2”项样品溶液制备方法操作,按上述色谱条件进样分析,记录峰面积,外标法计算槲皮素和山奈酚含量。测得槲皮素平均含量为0.098 13 mg·g-1,RSD=1.52%;山奈酚平均含量为0.085 93 mg·g-1,RSD=1.50%。结果表明,其重复性良好。

2.7 稳定性实验 分别于0,2,4,8,10,12 h吸取样品溶液注入色谱仪,测定峰面积。样品槲皮素RSD= 0.87%,山奈酚RSD=1.42%。结果表明,其稳定性良好。

2.8 加样回收率实验 称取已知含量的鹅不食草(批号:20121219)粉末约1 g,精密称定,分3组,每组3份,分别加入混合对照品溶液2.0,2.5,3.0 m L,按照样品溶液制备方法制备供试品溶液,共9份,按上述色谱条件测定其含量,计算回收率,槲皮素平均回收率为98.94%,RSD=1.95%,山奈酚平均回收率为99.76%,RSD=2.35%,结果见表1,2。

2.9 含量测定 精密称取3批鹅不食草粉末(批号: 20120725,20120916,20121219),每批3份,每份约2 g,照“2.2”项下样品溶液制备方法操作,按上述色谱条件进样分析,记录峰面积,外标法测定其含量,结果见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的确定 槲皮素、山奈酚均为黄酮化合物,槲皮素最大吸收波长:带Ⅰ376 nm,带Ⅱ256 nm;山奈酚最大吸收波长:带Ⅰ370 nm,带Ⅱ267 nm[6]。为了便于同时测定,选二者的光谱交点370和260 nm进行比较,结果发现槲皮素、山奈酚的甲醇溶液在370 nm处吸收好,与其他组分有较好的分离,故选定370 nm为检测波长。

表1 槲皮素和山奈酚加样回收实验结果

表2 样品含量测定结果(n=3)

3.2 流动相的选择 本实验采用甲醇-0.2%磷酸体系来分离,考察甲醇-0.2%磷酸40∶60,45∶55,48∶52, 50∶50,60∶40,综合考虑分离度、峰形、回收率等因素,确立以甲醇-0.2%磷酸(45∶55)为流动相分离最好,确定流速为0.8 mL·min-1。针对中药材的特殊性,加装了预柱,以保护色谱柱,提高分析方法的准确性。

3.3 提取方法的选择 考察提取时间20,30,40,60, 120 min,结果以每次超声60 min为最佳,还考察提取溶剂乙醇、甲醇,最后确立甲醇为提取溶剂,考察30%,50%,70%,90%,100%不同浓度甲醇的超声提取,结果以90%甲醇提取最佳,最后考察盐酸的加入量15,20,25,30 mL,结果15 mL盐酸即可完全水解,并且若加入的酸过多,会腐蚀设备,故确定盐酸用量为15 mL。

3.4 系统适用性 在此色谱条件下,槲皮素与山奈酚有足够大的峰值,基线噪音小,样品中的槲皮素、山奈酚与其他组分间有较好的分离度。本实验采用的HPLC法测定鹅不食草中的槲皮素、山奈酚,实验结果表明仪器精密度、样品稳定性、方法的重复性良好,为鹅不食草中黄酮类成分的质量控制提供重要依据。

3.5 药材含量 鹅不食草广泛分布于我国华北、华东、中南、西南地区,主产于湖北、江苏、浙江、广东和广西,野生于田埂、路边、房前屋后或荒野草地阴湿处[7]。目前从鹅不食草中主要分离得到黄酮、甾体、三萜和愈创木内酯类化合物。本实验所测鹅不食草中槲皮素、山奈酚含量较低,除提取方法可继续改进外,其含量还可能与鹅不食草的产地、种植或野生有关。故在本实验基础上,后续工作可进一步测定不同产地种植或野生的鹅不食草中槲皮素、山奈酚的含量,完善鹅不食草的质量控制标准。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:326.

[2] 林远灿,高明.鹅不食草的化学成分及药理研究进展[J].浙江中医药大学学报,2011,35(2):303-304.

[3] 高玉娇,梅全喜.鹅不食草的药理与临床研究进展[J].环球中医药,2010,3(4):307-309.

[4] 孙娟,余世春.槲皮素的研究进展[J].现代中药研究与实践,2011,25(3):85-87.

[5] 李乐,吕顺忠,唐辉.高效液相色谱法测定天山花楸叶中槲皮素和山奈素含量[J].医药导报,2013,32(7):928-929.

[6] 李化,于艳秋,杨滨.黄酮化合物与Fe(Ⅱ)络合反应的动力学研究[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(17):99-100.

[7] 梁军.鹅不食草的资源、提取工艺及药理研究[J].黑龙江医药,2009,22(6):835-837.

DOI 10.3870/yydb.2014.06.032

R284.2;R927.2

A

1004-0781(2014)06-0802-03

2013-08-14

2013-09-17

韦文芳(1972-),女,广西上林人,主管药师,学士,研究方向:民族新药的开发研究。电话:(0)13978679458, E-mail:2227860396@qq.com。