乌司他丁对内毒素肺损伤大鼠的保护作用

林雪松,向军,蔡亚娜,汪乐

(1.浙江省台州市中心医院烧伤科,台州 318000;2.上海交通大学附属瑞金医院烧伤科,上海 200025)

乌司他丁对内毒素肺损伤大鼠的保护作用

林雪松1,向军2,蔡亚娜1,汪乐1

(1.浙江省台州市中心医院烧伤科,台州 318000;2.上海交通大学附属瑞金医院烧伤科,上海 200025)

目的 探讨乌司他丁对急性内毒素性肺损伤保护作用的机制。方法取SD大鼠20只,大鼠腹腔注射脂多糖(LPS)5mg·kg-1·d-1,按随机数字表法将大鼠分配进入乌司他丁组和对照组各10只。乌司他丁组静脉给予乌司他丁50 kU·kg-1,对照组给予等量0.9%氯化钠溶液,观察大鼠水通道蛋白-1(AQP-1),AQP-5的表达变化及肺泡壁厚度变化以及肺水肿的程度。结果对照组大鼠体内注射LPS后,AQP-1及AQP-5的表达持续性降低,乌司他丁组AQP-1及AQP-5降低不明显;对照组肺组织湿/干质量比值明显增高,乌司他丁组无明显变化。对照组24,48,72 h的肺泡壁厚度(3.84±0.68),(6.32±1.08),(11.03±2.47)μm,乌司他丁组分别为(2.31±0.44),(3.76±0.82),(2.94±0.67)μm,无明显变化。结论AQP-1及AQP-5通过调节细胞通透性而导致肺水肿,乌司他丁通过减缓上述过程从而减轻内毒素性肺损伤的程度。

乌司他丁;损伤,肺,急性;内毒素;水通道蛋白

机体严重创伤及感染后常伴有急性肺损伤,可进一步发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ARDS最初的病理生理变化是肺微血管内皮细胞损伤,引起微血管壁通透性增加,肺泡内及间质水肿、纤维素渗出,并损伤肺泡上皮,加重呼吸窘迫。因此,肺微血管通透性增加是急性肺损伤及ARDS等病变的一个关键因素。许多研究证实,通过抑制烧伤后炎症反应,在一定程度上能改善烧伤后的脏器损伤。乌司他丁(ulinastatin)属于蛋白酶抑制药,有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶释放及进一步抑制过度炎症反应的作用,广泛应用于大面积烧伤及急性胰腺炎患者[1]。本实验中,笔者一方面观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后肺组织炎症因子及水通道蛋白(aquaporin,AQP)等功能蛋白的变化,另一方面应用乌司他丁观察其对肺损伤的保护作用,从而初步探讨乌司他丁对肺脏保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 试药及仪器 AQP-1及AQP-5单克隆抗体购于美国Abcam公司。配胶试剂:30%丙烯酰胺、1.5 mol·L-1Tris(pH8.8)、10%过硫酸铵(APS)、10%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、双蒸水等,电泳液:Tris 3.03 g,甘氨酸18.8 g,SDS 1 g,加纯化水配制1 000 mL;转膜液:Tris3.03 g,甘氨酸14.4 g,甲醇200 mL,加纯化水配制1 000mL;封闭液:5%脱脂奶粉。主要仪器:多功能酶标仪、电泳设备、转膜设备、湿盒、扫描设备等。LPS为大肠埃希菌脂多糖,上海慧颖生物科技有限公司,批号:20111105);乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司,批号:031004141)。

1.2 实验动物造模、分组 清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠20只,体质量170～200 g,购于复旦大学动物实验中心,生产许可证号:SCXK(沪)2009-0019,使用许可证号:SYXK(沪)2009-0082。予标准饲料,自由取水。按5 mg·kg-1·d-1剂量腹腔注射LPS。按随机数字表法将大鼠分配进入乌司他丁组和对照组各10只。乌司他丁组静脉给予乌司他丁50 kU·kg-1;对照组给予等量0.9%氯化钠溶液。分别于注射LPS后0,24,48,72 h取材检测。

1.3 肺组织标本收集 取血完毕后,沿胸骨旁夹断肋骨,打开胸腔,暴露双肺,自右侧肺门游离右肺,速冻于液氮,保存于-80℃。

1.4 Western blot检测肺组织AQP-1,AQP-5蛋白抽提肺组织总蛋白,测定肺组织总蛋白浓度,根据BCA蛋白定量试剂盒(BCA protein assay kit,PIERCE)流程说明书建立标准曲线,然后行SDS-PAGE电泳及蛋白质转移,膜的封闭和抗体孵育,将膜置于反应液中室温孵育5 min;去除过量的溶液,将膜夹在两塑料薄膜之间,以X光胶片曝光,显影图片扫描并用Image J分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。

1.5 肺组织切片染色及肺泡壁厚度测定 随机选取每个组的每个时间点5张苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)切片,每张切片随机选取视野2个,镜下测量肺泡壁厚度,计算平均值。

1.6 肺组织湿/干质量比值 从各组大鼠左下肺切取肺组织200 mg,置于烘箱内80℃干烤24 h后,用托盘天平称质量并计算肺组织湿/干质量(W/D)比值,以W/D比值表示肺组织含水量,比值越大说明肺水肿越明显。

1.7 统计学方法 采用SPSS12.0版医学统计软件,变量以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,组内比较采用Dunnett's方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乌司他丁对AQP-1,AQP-5的影响 注射LPS后AQP-1及AQP-5的表达持续性降低,而同时注射乌司他丁后,AQP-1及AQP-5降低不明显。见图1,2。

2.2 肺组织湿/干质量比值 注射LPS 48～72 h后,肺组织湿/干质量比值明显增高,而乌司他丁组肺组织湿/干质量比值始终无明显变化。见图3。

2.3 肺泡壁厚度 注射LPS后,肺泡壁厚度明显增大,而乌司他丁组肺泡壁厚度无明显变化。见图4,5。

A:对照组;B:乌司他丁组图1 Western blot检测AQP-1和AQP-5的表达A.Control group;B.Ulinastatin groupFig.1 Detection on exp ression of AQP-1 and AQP-5 by Western blotmethod

A.AQP-1;B.AQP-5;与对照组比较,*1P＜0.01;*2P＜0.05图2 两组不同时间AQP-1和AQP-5蛋白表达量A.AQP-1;B.AQP-5;Compared with the control group,*1P＜0.01;*2P＜0.05Fig.2 Expression of AQP-1 and AQP-5 between two groups in d ifferent time

3 讨论

AQP对水的通透性具有高度选择性,水分子可以通过水通道向高渗方向移动[2]。AQP-1在呼吸道及肺都有表达;AQP-5分布在Ⅰ型肺泡上皮细胞的顶膜上[1]。在肺泡上皮细胞的基底膜和侧膜上以及呼吸道上皮细胞的顶膜上未发现AQP存在[3]。

与对照组比较,P＜0.01图3 两组不同时间肺组织湿/干质量比Compared with the control group,*1P＜0.01Fig.3 The wet/dry weight ratio of two groups at different time points

与对照组比较,*1P＜0.05,*2P＜0.01图4 两组不同时间肺泡壁厚度Compared with the control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01Fig.4 Thickness of alveolar walls of two groups at different time points

A、B、C为对照组24,48,72 h;D、E、F为乌司他丁组24,48,72 h图5 两组肺组织切片染色图(HE,×400)A,B,Cwere control groups in 24,48,72 h,respectively;D,E,F were ulinastatin groups in 24,48,72 h,respectivelyFig.5 Lung histopathology of two groups of mice(HE,×400)

严重的大面积烧伤常伴有急性肺损伤,作为一种蛋白酶抑制药,乌司他丁具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶释放及进一步抑制过度炎症反应的作用[1],广泛应用于大面积烧伤患者。

肺组织湿/干质量比及肺泡壁厚度反映肺水肿的程度,经LPS刺激后,肺组织的水肿程度持续性加重,经乌司他丁干预后,肺组织湿/干质量比值及肺泡壁厚度变化不大,提示乌司他丁的重要的保护作用。

肺微血管内皮细胞通透性的增加导致肺水肿,内皮细胞通透性包括透细胞通透性及旁细胞通透性,内皮细胞膜表面有多种调节细胞通透性的蛋白,如AQP、caveolin及钠通道,在本实验中发现LPS可下调AQP-1及AQP-5,而乌司他丁干预后,AQP-1及AQP-5表达无明显变化,同样也提示乌司他丁对肺组织的重要的保护作用。在以往关于LPS或烧伤对肺组织AQP的影响的研究中发现,烧伤先引起肺组织AQP-1上调随后下调表达,下调肺组织AQP-5的表达,其中关于AQP-1的研究与本实验结果并不一致。笔者推测LPS刺激或烧伤后AQP-1的上调表达可能发生在较短时间内,即发生在LPS刺激早期,是对LPS刺激的急性反应,或者说是对LPS刺激后机体产生的代偿性保护作用。而在LPS持续的不间断的刺激下,机体产生对LPS的不同程度的耐受,这种保护性代偿反应随之消失,使AQP-1表达下调,肺组织微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞水钠转运失调,肺水肿逐渐加重。

[1] ZHANG Y W,BI L T,HOU SP,et al.Reduced lung water transport rate associated with downregulation of aquaporin-1 and aquaporin-5 in aged mice[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(7):734-738.

[2] ECHEVARRIA M,MUNOZ-CABELLO A M,SANCHEZSILVA R,et al.Development of cytosolic hypoxia and hypoxiainducible factor stabilization are facilitated by aquaporin-1 expression[J].J Biol Chem,2007,282(41):30207-30215.

[3] GAO C,HUAN J,LIW,et al.Protective effects of ulinastatin on pancreatic and renal damage in rats following early scald injury[J].Burns,2009,35(4):547-552.

DOI 10.3870/yydb.2014.06.006

Protective Effect of Ulinastatin on LPS-induced Lung Injury

LIN Xue-song,XIANG Jun,CAI Ya-na,WANG Le
(1.Department of Burn,Taizhou Central Hospital, Taizhou 318000,China;2.Department of Burn&Plastic Surgery,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200025,China)

ObjectiveTo investigate the protection mechanism of ulinastatin on bacterial endotoxin-induced acute lung injury.MethodsAcute lung injury was induced by Escherichia colilipo-polysaccharide(LPS)5 mg·kg-1·d-1,intratracheally. Twenty SD ratswere randomly divided into controlgroup(n=10)and ulinastatin group(n=10).Ulinastatid group received ulinastatin 50 kU·kg-1,the control groups received the same amount of 0.9%sodium chloride solution.Then the expression changes of rat AQP-1 and AQP-5,alveolar wall thickness change and the degree of pulmonary edema were detected.ResultsAfter the injection of LPS into the rat,the expression of AQP-1 and AQP-5 in control group were continuously decreased,but those in ulinastatin group decreased were not obvious.The lung wet/dry weight ratio in the control group increased significantly,the not obvious changes in the ulinastain group.The thickness of the alveolar in 24,48,72 h of the control group were(3.84±0.68),(6.32±1.08),(11.03±2.47)μm, respectively,and those in the ulinastian groupswere(2.31±0.44),(3.76±0.82),(2.94±0.67)μm,respectively.ConclusionThe AQP-1 and AQP-5 induced the occurrence of pulmonary edema by changing the cell permeability.Ulinastatin can slow down the process so as to reduce the degree of endotoxin-induced lung injury.

Ulinastatin;Injury,lung,acute;Endotoxin;Aquaporin

R965

A

1004-0781(2014)06-0718-04

2013-10-15

2014-01-20

林雪松(1970-),男,浙江台州人,副主任医师,学士,从事烧伤外科临床工作。电话:(0)15257699000,E-mail:linxuesg@163.com。

向军(1968-),男,上海人,副主任医师,硕士,从事烧伤科工作。电话:(0)13801789791,E-mail:13801789791@163.com。