瑞香狼毒叶提取物对皮肤石膏样毛癣菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用

田仁君

(四川中医药高等专科学校,绵阳 621000)

瑞香狼毒叶提取物对皮肤石膏样毛癣菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用

田仁君

(四川中医药高等专科学校,绵阳 621000)

目的 研究瑞香狼毒叶提取物对常见皮肤表面菌的抑菌活性。方法采用药敏纸片法和二倍稀释法测定瑞香狼毒叶提取物对石膏样毛癣菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用。结果瑞香狼毒叶95%乙醇提取物浓度为100 mg·mL-1时对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径达12.8 mm,对石膏样毛癣菌抑菌圈直径达12.0 mm,二氯甲烷萃取物对金黄色葡萄球菌最低抑制浓度(MIC)为0.25mg·mL-1,对石膏样毛癣菌MIC为0.50mg·mL-1。结论瑞香狼毒叶提取物对石膏样毛癣菌和金黄色葡萄球菌均有抑制活性,其中对金黄色葡萄球菌抑制活性较强。

瑞香狼毒叶提取物;抑菌活性;最低抑菌浓度

狼毒是一种不常用的中药,其味苦辛、性平、有毒,瑞香狼毒是狼毒的正名,为瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒的干燥根,又名断肠草[1]。历代本草中狼毒是以瑞香科植物瑞香狼毒根收载入药,具有清热解毒、消肿、泻炎症、止溃疡、祛腐生肌功能[2-3]。瑞香狼毒根提取物可以治疗实体瘤、肺结核和牛皮癣,据最新报道还有抗病毒的作用,尤其是抗人免疫缺陷病毒的作用[4-7]。而瑞香狼毒地上部分茎和叶的化学成分以及生物活性还少见研究。人体皮肤表面菌主要由金黄色葡萄球菌和真菌石膏样毛癣菌为代表,笔者以上述两种人体皮肤表面菌为研究对象,对瑞香狼毒叶提取物进行抑菌活性研究,发现瑞香狼毒叶可抑制人皮肤表面菌,报道如下。

1 材料与方法

1.1 药材 瑞香狼毒叶采自四川甘孜州的天然草场,将采回的瑞香狼毒叶阴干、粉碎备用(四川大学生命科学学院侯太平教授鉴定为正品瑞香狼毒);金黄色葡萄球菌、石膏样毛癣菌(均由四川成都检验检疫局提供标准菌株)。将菌株沾取微量的菌苔接种于培养皿中培养,将培养好的典型单菌落转种于灭菌的冷却液体培养基中,利用摇床37℃培养成原液。用灭菌水把原菌液稀释成浓度10-1、10-2、10-3……。每个浓度取2mL与培养基30mL混匀倒3个平板,27℃培养箱中培养,选生长菌落数在30～300个稀释浓度作为实验菌液,金黄色葡萄球菌实验菌液为10-7,石膏样毛癣菌实验菌液为10-4。

1.2 仪器 RE52-98旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂制造);W201B恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司);SHB-3循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);802型超净工作台(天津医疗净化设备厂);隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);手提式压力蒸汽消毒器(成都胜利医用设备厂);游标卡尺(上海精美量具厂);生物显微镜(上海光学仪器厂);Ws70-1型红外线快速干燥器(上海银屏仪器仪表有限公司)。

1.3 瑞香狼毒样品提取 称取适量瑞香狼毒叶粉,用95%乙醇、无水乙醇回流提取,每种溶剂提取3次,合并3次提取液,利用旋转蒸发仪进行浓缩至膏状物,得到95%乙醇提取物和无水乙醇提取物[8-9]。将上述抑菌活性高的95%乙醇提取物,利用石油醚、二氯甲烷、丙酮、甲醇进行依次萃取。萃取在分液漏斗中进行,萃取溶剂用量按照少量多次进行。每次萃取完毕将萃取液分离出来,再将剩下的进行第二次萃取,以此类推,将多次萃取液合并浓缩至膏状物。分别得到石油醚提取物、二氯甲烷提取物、丙酮提取物、甲醇提取物[9-10]。

1.4 乙醇粗提物的抑菌活性(药敏纸片法) 将溶解均匀的提取物用纯化水稀释为100,40,16, 6.4 mg·m L-14个浓度,以不加药而加入样品溶解剂的培养液作为空白对照。将浓度为10-7金黄色葡萄球菌菌液接种在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上,浓度为10-4石膏样毛癣菌菌液接种在沙氏平板上。将灭菌冷却好的直径为6 mm圆纸片在稀释好的提取样品中浸泡透后取出,酒精灯上微烘后,依次贴于平板的位置3个,同时贴上空白对照。将贴好纸片的培养皿轻放在37℃恒温培养箱中培养,细菌培养24 h,真菌27℃培养5 d,然后利用游标卡尺测定抑菌圈直径[11-12]。每个样品浓度平行做3次取平均值。

1.5 萃取物的抑菌活性 最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的测定:将灭菌好的装有培养液试管排列在试管架上,第一管的装量6 mL、其余都为3 mL[12-13]。加入药液并稀释:于第一支试管加入原药液1 g,混匀后吸取3.0 mL加入第二管中,同法依次稀释试管,最后一管弃去3.0 mL,使之成为递减系列浓度。并同时设对照组。趁热将试管放斜面,待培养液凝固后接入菌液0.1 mL,放于培养箱中培养,金黄色葡萄球菌37℃培养24 h后观察结果,石膏样毛癣菌27℃培养5 d后观察结果。从无菌生长的各管中找出最低药物浓度的试管,该管的药物浓度,即MIC[7]。最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)测定:待测定完MIC后,用接种环挑取无菌生长的试管上的培养物移种至不含样品的斜面上,培养1～3 d后观察有无菌落生长,未见菌落生长的试管所对应的浓度即为最低杀菌浓度[7]。

1.6 二氯甲烷样品对两种菌处理后镜检 将样品制成浓度为2.5 mg·m L-1(10倍MIC)含药平板,待平板在无菌室冷却后取直径为6 mm的石膏样毛癣菌菌碟倒贴在药平板上,同时设空白对照,27℃培养5 d后400倍显微镜下观察菌丝形态变化。将样品稀释成浓度为2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含药培养液,取10-7金黄色葡萄球菌菌液接种于含药培养液中,同时设空白对照,37℃水浴振荡培养24 h,取菌液0.01 mL滴加在平板上,37℃培养24 h,挑取平板上的菌落在400倍显微镜下观察细菌形态变化[14]。

1.7 二氯甲烷样品对真菌和细菌的生长曲线的影响[15]细菌:将样品稀释成浓度为2.5 mg·mL-1(10倍MIC)的含药培养液,接种金黄色葡萄球菌后在摇床上培养,设不加药为对照。分别于2,4,6,8,10,12, 14,16,18,20 h取菌液,稀释为10-7,取10-7菌液0.01 mL滴加在平板上,培养计数。真菌:将样品稀释成浓度为2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含药平板,设不加药为对照。培养液平面上均匀放入新生长一致的三个石膏样毛癣菌的菌饼(直径6 mm),将菌饼带菌丝的一面倒贴培养液表面,然后放入27℃的恒温培养箱培养,在第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10天定时测定平板上菌落的直径增长,用十字交叉法测每个菌落的两个直径,以其平均值代表菌落的直径[12-13,16]。

2 结果

2.1 乙醇粗提物的抑菌活性 结果见表1,2。从表1和表2可以看出瑞香狼毒叶95%乙醇提取物和无水乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和石膏样毛癣菌都有抑菌作用,95%乙醇提取物抑菌效果明显强于无水乙醇提取物,对金黄色葡萄球菌的抑菌效果略强于石膏样毛癣菌。当提取物浓度为100 mg·mL-1时,95%乙醇提取物抑菌圈高达12.8 mm。且随着提取物浓度的增加两种提取物抑菌效果也增加。所以选择95%乙醇提取物作为下一步提取分离活性成分的起始物。

2.2 MIC和MBC 结果见表2。表3可以看出4种萃取物对2种皮肤菌都有不同程度的抑菌和杀菌效果,二氯甲烷萃取物抑菌和杀菌活性最高,其次是丙酮萃取物、甲醇萃取物,石油醚萃取物。二氯甲烷萃取物对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC值为0.25 mg·mL-1,对石膏样毛癣菌MIC和MBC值高达0.5 mg·mL-1。所以实验选择二氯甲烷萃取物样品作为抑菌机制研究的样品。

表1 95%乙醇和无水乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和石膏样毛癣菌的抑菌圈直径Tab.1 Diameter of inhibition zone of Staphylococcus aureus and Trichophyton gypseum treated with 95%ethanol and anhychrous ethanol extract mm

表中数据为抑菌圈直径,0.00表示没有抑菌圈形成,滤纸片直径为6.00 mm

Data in the table represent inhibition zone.“0.00”means no inhibition zone.The diameter of filter paper is6.00mm

2.3 镜检结果 结果见图1,2。图1A可以看出石膏样毛癣菌对照组菌丝分支均匀,节与节之间连接紧密,而图1B处理组的菌丝分支扭曲混乱,节与节之间间距大,许多还有脱节现象,顶端有异常分支及膨大。图2A可以看出金黄色葡萄球菌对照组菌外表光滑,呈球型串珠状,而图2B处理组中菌体间完全粘连在一起呈麻绳状,菌体扭曲变形呈现不规则形状,完全看不出是什么菌种。

2.4 生长曲线 结果见图3,4。从图3中可以看出样品对金黄色葡萄球菌生长曲线影响非常明显,CK曲线6 h前是延滞期,6～14 h是指数期,14～20 h是稳定期,处理组没有达到正常的生长高峰,8 h后就进入衰亡期,从曲线可以推断药物主要抑制菌的指数期。图4中CK生长曲线显示3～7 d石膏样毛癣菌出现了快速生长,7 d以后缓慢生长处于稳定期,而药物处理后菌的生长速度明显减慢,对菌的每个生长期都有不同程度的抑制。

3 讨论

本文最初提取溶剂选择乙醇,因为乙醇是一种广谱性溶剂,溶解能力强,溶解范围广,同时在有机溶剂中它最便宜,毒性最低,安全性最高,所以选择乙醇作为最先的提取溶剂。萃取溶剂选择是参考有机溶剂的介电常数,石油醚(1.8)、二氯甲烷(9.08)、丙酮(20.7)、甲醇(32.7),溶剂的极性跟介电常数成正比[16],因此选用极性差别大且覆盖极性范围广的这4种溶剂作为萃取溶剂。

表2 4种萃取物对金黄色葡萄球菌和石膏毛癣菌的MIC、MBC Tab.2 MIC and MBC of four kinds of extracts on Staphylococcus aureus and Trichophyton gypseum mg·mL-1

A.真菌对照;B.真菌处理图1 二氯甲烷样品对真菌处理后镜检图(×400)A.Fungus control;B.Fungus treatmentFig.1 Microscopic exam ination on fungus treated with DCM sample(×400)

A.细菌对照;B.细菌处理图2 二氯甲烷样品对细菌处理后镜检图(×400)A.bacterial control;B.bacterial treatmentFig.2 Microscopic exam ination on bacterial treated with DCM sam p le(×400)

图3 金黄色葡萄球菌生长曲线图Fig.3 Grow th curve of Staphylococcus aureus

图4 石膏样毛癣菌生长曲线图Fig.4 Grow th curve of Trichophyton gypseum

药物处理后镜检发现真菌菌丝生长缓慢,生长明显受到抑制,菌丝层稀薄,菌丝粗细不均匀并且扭曲变形,节与节之间有断裂现象。对真菌生长曲线的观察,主要影响指数生长期,因此可以推测药物可能抑制真菌细胞分裂。具体抑制其中哪些物质还有待进一步研究。镜检发现细菌外形粗糙,菌体间粘连扭曲成麻绳状,细胞形态不规则,显著变形。而干扰细胞壁合成的药物常会引起细胞形态的显著变形,故推测药物可能阻止或干扰了细菌细胞壁的合成来达到抑菌效果。具体抑菌机制还需进一步研究证实。

实验结果证明,瑞香狼毒叶中含有抑皮肤菌的高活性成分,这些成分的极性与二氯甲烷相近,至于是单体化合物还是混合物还有待进一步提取分离。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.010

Inhibition of Extract from Leaf of Stellera chamaijasme L on Dermatic Staphylococcus aureus and Trichophyton gypseum

TIAN Ren-jun
(Sichuan Traditional Chinese Medicine Junior College,Mianyang 621000,China)

ObjectiveTo study the antibiotic activities of leaf extract ofStellera chamaejasmeLon the skin.MethodsActivities of the leaf extract onTrichophyton gypseumandStaphylococcus aureuswas examined by antibiotic susceptibility paper disk method and tube double dilution method.ResultsWhen extracted by 95%ethanol,the extract fromStellera chamaejasmeL at 100 mg·mL-1formed an inhibition zone with the diameter of 12.8 mm forStaphylococcus aureusand 12.0 mm forTrichophyton gypseum.When extracted by dichloromethane,the minimum inhibitory concentration(MIC) of the extract fromStellera chamaejasmeLwas0.25mg·mL-1forStaphylococcusaureusand 0.50mg·mL-1forTrichophyton gypsem.ConclusionLeaf extract ofStellera chamaejasmeL has an antibacterial activity againstStaphylococcus aureusandTrichophyton gypseumand the antibacterial activity againstStaphylococcus aureusis stronger.

Extract of the leaf ofStellera chamaejasmeL;Antibiotic activity;Minimal inhibitory concentration

R285

A

1004-0781(2014)06-0729-04

2013-06-10

2013-09-06

田仁君(1978-),女,四川南充人,讲师,硕士,主要研究方向;中药化学。电话:(0)18030999773,E-mail:skytrjll@163.com。