银杏内酯B通过激活孕烷X受体诱导CYP3A4的表达

周 涛，王宇光，马增春，肖 勇，汤响林，梁乾德，胡东华，肖成荣，谭洪玲，高 月

（1.广西医科大学药学院，广西 南宁 530021；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）

银杏作为药用植物资源用于疾病的治疗有着悠久的历史，在中医临床实践中具有确切的疗效。银杏叶提取物应用于多种老年性疾病以及神经及精神性疾病和心脑血管疾病的治疗。银杏内酯A、B、C等是天然的血小板活化因子拮抗剂，对中枢神经系统和心血管系统有保护作用；银杏内酯的含量是评价银杏叶提取物质量的关键［1－2］。现在很多国家将银杏叶提取物批准作为保健品和食品添加剂长期使用，使得联合用药时发生药物相互作用的几率大大增加，因此有必要对其安全性，特别是药物相互作用进行深入研究，为合理用药和确保用药安全性提供实验依据［3］。

细胞色素 P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）是CYP超家族中重要的同工酶之一，参与临床上超过50%常用药物以及一些环境化学物的氧化代谢，在人体肝脏和结肠中表达最为丰富，研究药物对CYP 3A4的诱导作用对于预测潜在的药物相互作用，从而确保用药安全具有重要临床指导意义［4－6］。

孕烷X受体（pregnane X receptor，PXR）是近年来发现的CYP3A4转录调节因子，许多药物和环境化学物可以通过PXR调节CYP3A4的转录，从而影响多种作为CYP3A4底物的药物或环境化学物的代谢，导致药物相互作用发生，甚至产生药物不良反应，PXR的发现为研究CYP3A4的诱导机制开拓了新的领域［7－9］。

因此研究银杏内酯B对CYP3A4的诱导作用及其与PXR关系，有助于进一步了解银杏内酯B产生药物相互作用的可能机制，为临床合理用药提供基于药物代谢酶层面的药理学指导。

1 材料与方法

1.1 标准品（药物）银杏内酯 B，20mg，批号：110863－201209，购于中国食品药品检定研究院。利福平（Rifampicin，RIF），1 g，批号：B74218，美国Merck公司产品。

1．2 细胞与 siRNAPXR-CYP3A4稳定转染的HepG2细胞株由本实验室构建并保存，人结肠癌细胞系LS174T由本实验室保存。小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）由 Invitrogen公司合成，序列见Tab 1。

1.3 试剂及仪器MEM培养基（批号：NWE0403）、EDTA胰酶（批号：SLBC7668）、非必需氨基酸（NEAA，批号：AWG16123）、胎牛血清（批号：NXA0544）均为美国Hyclone公司产品；Guisssia荧光检测试剂盒（批号：0451201）为美国NEB公司产品；Victor X5微板读数仪为美国PerkinElmer公司产品，P450-GloTMCYP3A4 Assay with Luciferin-IPA，（批号：0000009296）购于美国 Promega公司。LipofeetaminTM2000购于美国Invitrogen公司；QPCR仪器和试剂购于AB公司，Western blot试剂盒购于Promega公司，显影照相Clinx chemiscopemini3400。荧光显微镜AXIOVERT 200。

Tab 1 siRNA sequences used for transfection

1．4 Q-PCR检测给药前1 d，0.25%胰酶消化LS174T细胞并计数，再以1×105/孔接种于24孔板中，37℃、5%CO2孵箱培养。次日不同浓度的银杏内酯B加入至不含有胎牛血清的MEM，中再分别加入24孔板中，轻摇混匀，37℃5%CO2孵箱培养。给药24及48 h后，利用TRIzol试剂提取细胞总RNA。

以2μg RNA为模板，加入至20μl RT反应体系中，Q-PCR具体操作参照说明书进行。特异性引物序列见Tab 2

Tab 2 Primer sequences used for Q-PCR reactions

1.5 蛋白质免疫印迹法细胞的培养和药物处理同上，将6板孔中不同处理的细胞样品用预冷PBS洗2次，150μl细胞裂解液冰上裂解20 min，上清即为全细胞裂解液。蛋白定量采用BCA方法。上清与等体积2×SDS上样缓冲液混合均匀，100℃沸水浴煮20 min。样品经过电泳、转膜、封闭、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜，最后用Clinx chemiscopemini 3400检测仪进行拍照。

1.6 细胞荧光素酶报告基因检测给药前1 d，以1×105/孔接种于96孔板中，37℃、5%CO2孵箱培养。次日，不同浓度的受试银杏内酯B加入至含有双抗培养基的96孔板中，37℃5%CO2孵箱培养。利用建立的稳定转染细胞株进行PXR激活特性筛选，筛选药物成分的浓度梯度为5、10、50、100μmol·L－1，设置阳性对照组（RIF，10μmol·L－1），溶剂对照组（DMSO，0.1%），每种药物设置6个复孔，加药36 h后，吸取细胞培养液上清，进行荧光检测。荧光素酶活性的检测用NEB BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit检测试剂盒，在 BioLux Gluc Assay Buffer 1mL中加BioLux Gluc Substrate 10μl。吸取20μl细胞培养基上清至检测板孔中，然后每孔加入50μl荧光检测试剂。最后用酶标仪进行化学发光检测。

1．7 siRNA转染LS174T细胞并敲低PXR的m RNA表达转染前24 h，在500μl无抗培养基中接种0.5×105～2×105/孔细胞于24孔板中，转染时细胞融合度为30% ～50%。用50μl MEM稀释siRNA（转染细胞的终浓度为33μmol·L－1）。轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μlMEM稀释2.0μl LipofeetaminTM2000，室温下静置5 min。混合转染试剂和siRNA稀释液，室温下静置20 min。转染复合物加入至24孔细胞板中，100μl/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于37℃5%CO2孵箱培养箱中培养。转染6 h后换新鲜培养基。培养24 h后，给不同的药物浓度处理细胞。培养24 h后，按上述方法提取总RNA进行Q-PCR检测PXR和CYP3A4的mRNA表达。

1.8 数据处理采用SAS9.2统计软件进行t检验，各组数据均以±s表示，两组间比较用t检验。

2 结果

2．1 银杏内酯B对LS174T细胞CYP3A4 m RNA表达的影响

2.1.1 银杏内酯B加药处理LS174T细胞24h和48h后对CYP3A4 mRNA表达的影响 利用Q-PCR技术扩增CYP3A4 mRNA，结果显示，与正常对照组比较，银杏内酯B能够明显诱导CYP3A4的表达，当银杏内酯B浓度为150μmol·L－1诱导最明显，最高诱导倍数为8倍。其中利福平（RIF）作为阳性对照，诱导CYP3A4 mRNA的表达的倍数是9.5倍（P＜0.01），随着银杏内酯 B浓度的增加，CYP3A4 mRNA的表达也呈现上升趋势，见Fig 1。

2.1.2 银杏内酯 B浓度为60μmol·L－1下，不同给药时间对LS174T细胞CYP3A4 mRNA表达的影响 银杏内酯B（60μmol·L－1）给药组与正常对照组比较，银杏内酯B能够明显诱导CYP3A4的表达。其中24、36、48 h可明显诱导 CYP3A4 mRNA的表达（P＜0.01），随着药物处理细胞时间的延长，CYP3A4的表达也逐渐上升，至48 h达到最大。诱导倍数是5倍，呈现明显时间依赖性。Q-PCR的结果见Fig 2。

Fig 1 Effect of Ginkgolide B on the expression ofCYP3A4 mRAN in concentration-dependentmanner（±s）

Fig 2 Effect of Ginkgolide B on CYP3A4 gene expression（±s）

2．2 银杏内酯 B加药处理 LS174T细胞对CYP3A4表达在蛋白质水平的影响

2.2.1 银杏内酯 B不同浓度给药48 h后对LS174T细胞CYP3A4蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，银杏内酯B对CYP3A4蛋白表达同样具有明显诱导作用，且随着银杏内酯B浓度的增加CYP3A4蛋白质表达增加。见Fig 3。

Fig 3 Effect of Ginkgolide Bon protein expression vs control group

2.3 细胞给药荧光素酶报告基因检测荧光素酶报告基因检测显示，银杏内酯B能够明显增强PXR转录活性。如Fig 4所示，利福平（RIF）作为阳性对照，可明显增强 PXR转录活性达8.5倍（P＜0.01），随着银杏内酯B浓度的增加，PXR转录活性呈浓度依赖性增强，10、50、100μmol·L－1时以此达到3.5倍、4倍、5倍之多。

Fig 4 Ginkgolide B transactivated CYP3A4 reporter via PXR in concentration-dependentmanner（±s）．

2．4 通过siRNA敲低PXR表达对LS174T细胞表达的影响PXR靶基因涉及众多药物代谢和转运以及耐药相关基因，RNAi特异性抑制PXR表达后，可能会相应地改变其靶基因表达，从而影响细胞对药物的敏感性和药物的相互作用。本研究目的在于特异性沉默PXR基因表达，并检测在PXR敲低的条件下，银杏内酯B对LS174T细胞CYP3A4表达，与未敲低PXR条件相比，是否会发生变化，从而进一步的证明银杏内酯B是通过PXR途径对CYP3A4的表达进行调控。

2.4.1 转染效率的结果 为考察siRNA的转染效率，首先利用荧光（FAM）标记的siRNA对照组进行脂质体转染效率的检测，结果如Fig 5所示，荧光显微镜下FAM荧光基团检测显示转染效率较高。

2.4.2 siRNA干扰后对LS174T细胞CYP3A4 mRNA和PXR mRNA表达的影响 分别考察1-RNAi和2-RNAi两条序列对PXR敲低作用，结果显示，1-RNAi和2-RNAi分别与对照组相比都能明显地敲低PXR mRNA的表达（P＜0.01），在敲低PXR的条件下，加入银杏内酯B不会增加PXR mRNA的表达（Fig 6），但在敲低PXR的条件下，银杏内酯B仍能够诱导CYP3A4 mRNA表达（P＜0.05），且随着银杏内酯B浓度的增加，CYP3A4 mRNA的表达也呈现上升趋势，最高诱导倍数为2倍，但诱导倍数明显低于未敲低PXR时银杏内酯B对CYP3A的诱导作用（最高诱导倍数为8倍）。Q-PCR的结果见Fig 7。

Fig 5 Effect of FAM-siRNA transfection on fluorescencem icroscopy

Fig 6 Effect of Ginkgolide B on PXR mRNA gene expression（±s）

Fig 7 Effect of Ginkgolide B on CYP3A4 gene expression（±s）

3 讨论

利用本实验室前期创建的基于分泌型Gaussia荧光素酶报告基因pGLuc-Basic检测系统，将报告基因载体与人PXR基因表达载体共转染于HepG2细胞，通过G418抗性筛选从而获得稳定转染的工程细胞株，该细胞株使用分泌型荧光素酶载体，具备高通量潜力，检测方便；采用双远端增强子模式，实现可能的高灵敏度、高诱导、简化筛选步骤的特点，大大提高了筛选的通量及效率［10］。

本研究基于PXR-CYP3A4通路的药物相互作用快速筛选技术，筛选出银杏提取物中银杏内酯B在PXR-CYP3A4通路中具有诱导作用，从Q-PCR的结果可以看出，银杏内酯B对CYP3A4mRNA具有明显地诱导作用，且随着浓度和给药时间的增加表达也呈现上升趋势，具有时间和浓度效应。从蛋白水平进一步的确证银杏内酯B对CYP 3A4的表达具有明显的诱导作用，与mRNA水平的结果是一致的。

为进一步的确定银杏内酯B诱导CYP3A4机制是否通过激活PXR，本实验选择内源性PXR表达丰富LS174T细胞作为研究细胞载体，再通过siRNA敲低细胞内源性PXR表达，考察敲低PXR前后银杏内酯B对CYP3A4诱导作用的差异，进而评估PXR受体在银杏内酯B诱导CYP3A4中的作用。PXR靶基因涉及众多药物代谢和转运以及耐药相关基因，RNAi特异性抑制PXR表达后，可能会相应地改变其靶基因表达，从而影响细胞对药物的敏感性和药物的相互作用。本研究观察到特异性沉默PXR基因表达可相应降低LS174T细胞CYP3A4基础表达，表明PXR参与CYP3A4基础转录表达调控。RNAi特异性抑制PXR表达后，银杏内酯B不会增加 PXR mRNA的表达，但是能够明显增加CYP3A4 mRNA表达，且随着银杏内酯B浓度的增加CYP3A4 mRNA的表达也呈现上升趋势，但是诱导倍数明显低于未敲低PXR时银杏内酯B对CYP3A4诱导作用，结合报告基因筛选实验可以进一步的证明银杏内酯B是通过PXR途径诱导CYP3A4的表达。文献报道组成型雄烷受体（CAR）也可以调节 CYP3A4的表达［11－12］，银杏内酯 B可能也是CAR潜在的配体，在PXR敲低的情况下，推测银杏内酯B可能通过激活CAR对CYP3A4产生诱导作用，但作用明显弱于PXR对CYP3A的转录调控，说明PXR在对CYP3A4转录调控中起着主导的作用。

现已发现多种临床药物可以激活PXR，包括抑制素、钙通道拮抗剂、降糖药、抗激素药、HIV蛋白酶抑制剂、抗癌药以及某些中药［13－14］，通过配体激活PXR，从而使经由CYP3A4代谢的药物发生药物代谢动力学的改变，甚至可能引起更加严重的药物相互作用。本研究显示，银杏内酯B通过PXR途径诱导CYP3A4的表达，从而产生诱导作用，当其与其它药物合用时，可能使经由CYP3A4代谢的药物发生药物代谢动力学的改变，甚至可能导致严重的药物相互作用，为临床合理联合用药提供合理的依据。

参考文献：

［1］邓 颖，赵立子，毕惠嫦，等.银杏叶提取物及其萜类单体对人孕烷L受体介导CYP3A4转录的调节作用［J］.中药新药与临床药理，2009，20：234－7.

［1］Deng Y，Zhao L Z，BiH C，etal.Regulative effects of Ginkgo Biloba extractand its terpenoids on the orphan human pregnane X receptormediated transcriptional activation of CYP3A4［J］.Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol，2009，20：234－7.

［2］Stanley L A，Hors burgh B C，Wolf CR，etal.PXR and CAR nuclear receptors which play a pivotal role in drug disposition and chemical toxicity［J］.Drug Met Rev，2006，38：3515－97.

［3］程 婕，杨 凌.细胞色素P450氧化酶的研究进展［J］.中国药理学通报，2006，22（2）：129－32.

［3］Cheng J，Yang L.Research progression of cytochrome P450 reductase［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22（2）：129－32.

［4］胡东莉，刘丽娟，王 果，周宏灏.中草药对PXR的调节作用［J］.现代生物医学进展，2010，10：3980－3.

［4］Hu D L，Liu L J，Wang G，Zhou H H.Regulation of pregnane X receptor（PXR）by herbal［J］.Med Prog Mod Biomed，2010，10：3980－3.

［5］刘彦锋，李红星，颉欣妮，等.孕烷X受体的研究进展及其在药物代谢中的作用［J］.中国新药杂志，2008，17：1119－202.

［5］Liu Y F，LiH X，Xie X N，etal.Progress in research of pregnane X receptor and its effect on drug metabolism［J］.Chin J New Drugs，2008，17：1119－202.

［6］徐玉英，张 寅，周 凡，等.7种中药提取物对PXR介导的CYP3A4转录调节作用［J］.中国中药杂志，2011，11：1524－7.

［6］Xu Y Y，Zhang Y，Zhou F，et al.Human pregnane X receptormediated transcriptional regulation of CYP3A4 byextracts of 7 traditional Chinesemedicines［J］.JChin Mater Med，2011，11：1524－7.

［7］Ling H，Min H，Yu H L.Up-regulatation of CYP3A expression through pregnent X receptorby praeruptorin D isolated from Peucedanum praeruptorum Dunn［J］.J Ethnopharmacol，2013，148：596－602

［8］Le Cluyse E L.Pregnane X receptor：molecular basis for species differences in CYP3A induction by xenobiotics［J］．Chem Biol Interact，2001，134（3）：283－9.

［9］Yang X F，Wang N P，Lu W H.Effects of Ginkgo biloba extract and tanshinone on cytochrome P450 isoyzmes and glutathione transferase in rat［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，2：1033－8.

［10］Wang Y G，Ye X，Ma ZC，et al.Induction of cytochrome P450 1A1 expression by ginsenoside Rg1 and Rb1 in HepG2 cells［J］.Eur JPharmacol，2008，601：73－8.

［11］Li Y，Li Y.Pregnane X recep t or in the regulation mechanism to cytochrome P450 3A［J］.Res Prog J Int Pharm Res，2009，36：184－8.

［12］Wang Y G，Wang SQ，Liu Y G，et al.Identification ofmetabolites and P450 is ozymes involved in themicrosomalmetabolism of aconitine［J］.JChromatogr B，2006，844：292－300.

［13］Hasler JA，Estabrook R，Murray M，et al.Human cytochromes P450［J］.Mol AspectsMed，1999，20：1－137.

［14］王玉璘，王少峡，郭 虹，胡利民.血脑屏障中P-糖蛋白的调节机制［J］.中国药理学通报，2011，27（9）：1196－200.

［14］Wang Y L，Wang SX，Guo H，Hu LM.Regulatorymechanisms of P-glycoprotein at the blood-brain barrier［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（9）：1196－200.