二苯乙烯化合物Vam3对ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应的影响及机制研究

曹淑花，姚春所，侯 琦

（中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京100050）

据研究报道，细胞外ATP可作为一种“危险信号”，通过激活细胞膜上的P2嘌呤受体参与机体的免疫应答及炎症过程。P2嘌呤受体包括7种P2X离子型受体和8种P2Y代谢型受体，其中P2X7因结构和功能最具特异性，目前已得到较广泛研究［1］。Ferrari等［2］研究观察到，LPS活化的巨噬细胞受胞外ATP刺激后，P2X型受体（主要为P2X7）离子通道开放，大量K＋外流，Ca2＋内流，介导 NLRP3炎症复合体激活IL-1β转化酶caspase 1（interleukin 1βconverting enzyme，ICE），caspase 1将无活性的IL-1β前体转化为成熟的IL-1β，释放到细胞外。细胞外ATP激活caspase 1～IL-1β炎性通路，产物IL-1β在炎症性疾病的受损组织累积，影响免疫系统的正常功能［3］。ATP活化P2X7后，启动与炎症过程放大相关的一系列效应，包括NO自由基释放、ROS产生、NF-κB活化及基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotease-9，MMP-9）分泌等。高浓度ATP也可引起核染色质的浓缩、凝聚和DNA的降解，产生凋亡细胞［4］。

Vam3是中国医学科学院药物研究所植化室首次从山葡萄根提取得到的二苯乙烯类低聚化合物，为白藜芦醇二聚体同系物。本实验室前期研究发现Vam3可明显抑制多种炎症细胞内炎症因子的释放，在实验性小鼠哮喘及COPD模型中显示出良好的减轻小鼠肺部炎症的作用［5－6］。为更深入研究Vam3抗炎作用机制，本文通过观察Vam3对外源性ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症的影响，初步探讨其抗炎作用机制。研究思路与实验设计参考文献［1］，如 Fig 1所示。

Fig 1 P2X7～caspase 1～IL-1βinflammatory signaling pathway in macrophages［1］

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及仪器 Vam3（纯度≥98%）由中国医学科学院药物研究所姚春所课题组合成并提供；RPMI 1640培养基、胎牛血清购自 Hyclone公司；ATP、噻唑蓝（3-［4，5-dimethylthiazol-2-yl］-2，5-diphenyltetrazo lium bromide，MTT）、DCFH-DA探针及KN-62（1-［N，O-bis（5-isoquinolinesulphonyl）-N-methyl-L-tyrosyl］-4-phenylpiperazine）、β-巯基乙醇均购自Sigma公司；Fluo3-AM、Bradford蛋白浓度测定试剂盒及caspase 1酶活力检测试剂盒均购自江苏省碧云天公司；小鼠IL-1βELISA试剂盒购自Biolegend公司。TCS SP激光共聚焦显微镜购自美国Leica公司；台式低温高速离心机购自美国Sigma公司；多标记微孔板检测仪 EnSpire购自美国PerkinElmer公司；酶标仪购自美国BioTek公司；激光共聚焦专用玻底培养皿购自NEST公司；其余细胞培养板、培养皿均购自美国Corning公司。

1.1.2 小鼠腹腔巨噬细胞的提取和培养 ♂C57BL/6J小鼠，体质量18～20 g，购自中国军事医学科学院动物中心。小鼠腹腔注射3% 的β-巯基乙醇1 ml，于d 4处死后置于75% 的乙醇中消毒5 min，腹腔注射5 m l无菌PBS，轻轻揉捏小鼠腹部，缓慢吸出细胞液，反复3次。收集细胞悬液，离心，红细胞裂解液裂解5 min，含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（100 kU·L－1青霉素、100 kU·L－1链霉素）重悬，200目细胞筛网滤过后离心、重悬，于37℃、5%CO2孵箱中培养2 h贴壁，PBS洗1遍以去除非贴壁细胞，于孵箱中继续培养用于实验。

1.2 方法

1.2.1 IL-1β测定 小鼠腹腔巨噬细胞5×108·L－1，500μl/孔接种于48孔板，细胞贴壁2 h后 PBS洗1遍，LPS（1 mg·L－1）刺激过夜。PBS洗3遍，相应孔内分别加终浓度为1、5μmol·L－1Vam3及阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1），对照孔加等量DMSO，孵育2 h，每组设4个平行孔，加终浓度为2.5 mmol·L－1ATP刺激细胞，1 h后收集细胞上清，按ELISA试剂盒说明书操作步骤检测细胞上清中IL-1β水平。

1.2.2 caspase 1酶活力测定 取状态良好的小鼠腹腔巨噬细胞2×109·L－1，3 ml/皿接种于60 mm细胞培养皿，LPS（1 mg·L－1）置孵箱中刺激过夜。相应皿内分别加终浓度为1、5μmol·L－1Vam3及阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1），对照孔加等量DMSO，孵育2 h，每组设3个平行孔。加终浓度为2.5 mmol·L－1ATP刺激1 h，收集细胞，4℃，600×g离心5 min，PBS洗1遍，加入100μl裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min。4℃，18 000×g离心15 min，取细胞上清。Bradford法测定蛋白浓度，将蛋白浓度调节一致，立即测定caspase 1的酶活力。按说明书加入相应检测试剂及样品建立反应体系，于37℃孵育2 h，酶标仪测定A405。根据标准曲线，计算酶活力单位。

1.2.3 ROS测定 小鼠腹腔巨噬细胞5×108·L－1，100μl/孔接种于96孔板，细胞贴壁2 h后 PBS洗1遍，LPS（1 mg·L－1）刺激过夜。PBS洗3遍，相应孔内分别加终浓度为1、5μmol·L－1Vam3及阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1），对照孔加等量DMSO，孵育2 h。每组设5个平行孔。加终浓度为5 mmol·L－1ATP刺激细胞，1 h后吸出培养液，PBS洗2遍，加入含有DCFH-DA（终浓度为10μmol·L－1）的新鲜培养基，37℃避光孵育30 min。PBS洗3遍，加入新鲜培养基（无血清），荧光酶标仪测定细胞的吸光值（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。

1.2.4 MTT测定

1.2.4.1 ATP毒性测定 小鼠腹腔巨噬细胞1×109·L－1，100μl/孔接种于 96孔板。细胞贴壁 2 h后 PBS洗1遍，加终浓度为 1、2、5 mmol·L－1ATP，对照孔加等量DMSO，每组设4个平行孔。孵箱内孵育4 h，MTT法检测细胞增殖。

1.2.4.2 化合物抗ATP毒性测定 小鼠腹腔巨噬细胞1×109·L－1，100μl/孔接种于96孔板。细胞贴壁2 h后PBS洗1遍，相应孔内加终浓度为1、5 μmol·L－1Vam3及阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1），对照孔加等量DMSO孵育2 h，每组设4个平行孔。加终浓度为5 mmol·L－1ATP，孵箱内孵育4 h，MTT法检测细胞增殖。

1.2.5 细胞内Ca2＋测定 小鼠腹腔巨噬细胞3×107·L－1，1 ml接种于激光共聚焦专用玻底培养皿。细胞贴壁2 h后HBSS缓冲液洗3遍，于37℃、5%CO2孵箱中培养4 h，HBSS缓冲液洗3遍，加入含有Fluo3-AM（终浓度为 5μmol·L－1）的 HBSS缓冲液，37℃避光孵育30 min，吸出孵育液，HBSS缓冲液洗3遍，选定细胞视野，激光预扫描，然后设置测定条件［7］：激发波长为488 nm，发射波长525 nm；扫描方式：Xyt（时间扫描）；时间间隔：4 s；时长：5min。再根据预扫描的结果选取最清晰的焦平面进行扫描，然后随机圈定15～20个细胞，进行动态观察。第50 s时，加入终浓度为5μmol·L－1ATP的HBSS缓冲液的同时相应加终浓度为 1、5μmol·L－1Vam3及阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1），对照组加等量DMSO。记录细胞的荧光强度变化并用随机软件自动分析，细胞内Ca2＋浓度的变化以荧光强度值（intensity）表示，此数值与细胞内Ca2＋浓度变化呈正相关。所有试剂在有效剂量范围内都经证明不产生荧光干扰，染色条件和激光扫描参数在整个实验过程中不变，每组设3个平行样。

1.3 统计学处理实验数据以±s表示，采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析比较组间差异性。

2 结果

2．1 Vam3对ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β分泌水平的影响2.5 mmol·L－1ATP刺激小鼠腹腔巨噬细胞1 h后，IL-1β分泌水平明显升高，1、5 μmol·L－1Vam3及阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1）预孵育 2 h，2.5 mmol·L－1ATP刺激 1 h，IL-1β水平明显降低。与对照组相比，1、5μmol·L－1Vam3对 IL-1β分泌水平抑制率分别为78.3%、79.4%，均高于阳性对照药 KN-62（54.3%）（Fig 2）。

2．2 Vam3对 ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞caspase 1酶活力的影响2.5 mmol·L－1ATP刺激小鼠腹腔巨噬细胞1 h后，caspase 1酶活力明显升高。终浓度为1、5μmol·L－1Vam3及阳性对照药KN-62（1μmol·L－1）预孵育 2 h，2.5 mmol·L－1ATP刺激1 h，caspase 1酶活力明显降低。1、5μmol·L－1Vam3对caspase 1酶活力的抑制率分别为38.4%、51.8%，均高于阳性对照药KN-62（34.6%）（Fig 3）。

Fig 2 Effect of Vam3 on ATP-induced IL-1βproduction in LPS-primed mouse peritonealmacrophages（n＝4）

Fig 3 Effect of Vam3 on ATP-induced caspase 1 activity in LPS-primed mouse peritonealmacrophages（n＝3）

2．3 Vam3对ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞内ROS产生的影响设定不加ATP刺激的对照组小鼠腹腔巨噬细胞内ROS荧光值为100%，其它各组值为其细胞内ROS荧光值与对照组ROS荧光值相比得到的百分率。5 mmol·L－1ATP刺激1 h后，ROS水平明显升高，为对照组的123%。1、5μmol·L－1Vam3及阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1）预孵育2 h，ROS水平明显降低。与对照组相比较，1、5 mol·L－1Vam3组细胞内ROS荧光值分别为对照组的86.6%、74.2%，阳性对照药KN-62组为对照组的72.8%（Fig 4）。

Fig 4 Effect of Vam3 on ATP-induced ROS production in mouse peritonealmacrophages（n＝5）

2．4 Vam3对ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响与不加ATP刺激的对照组相比，1 mmol·L－1ATP对巨噬细胞增殖无明显影响；2和5 mmol·L－1ATP明显抑制细胞增殖，且剂量越高抑制作用越明显。终浓度为1、5μmol·L－1Vam3及阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1）预孵育 2 h，5 mmol·L－1的 ATP刺激4 h，5μmol·L－1Vam3对细胞增殖抑制有明显改善作用（Fig 5B）。

2．5 Vam3对 ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞Ca2＋内流的影响ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞内Ca2＋浓度（荧光强度值）－时间效应曲线如Fig 6A所示，5 mmol·L－1ATP使小鼠腹腔巨噬细胞内Ca2＋浓度快速上升，达到最大值下降，然后持续保持一定的平台期；加入5 mmol·L－1ATP的同时加入1、5μmol·L－1Vam3，阳性对照药物 KN-62（1μmol·L－1）后，细胞内Ca2＋浓度上升不明显。如Fig 6B所示，负载Fluo3-AM的小鼠腹腔巨噬细胞在受到5 mmol·L－1ATP刺激后，绿色荧光明显增强；加入5 mmol·L－1ATP的同时加入 1、5μmol·L－1Vam3，阳性对照药物 KN-62（1μmol·L－1），绿色荧光增强不明显。各处理组小鼠腹腔巨噬细胞内Ca2＋浓度（相对荧光强度）－时间效应曲线的曲线下面积如Fig 6C所示，曲线下面积代表Ca2＋细胞内流总量，在加入5 mmol·L－1ATP的同时加入1和5μmol·L－1Vam3，阳性对照药 KN-62（1μmol·L－1），细胞内Ca2＋总量得到明显抑制（Fig 6）。

3 讨论

Fig 5 Effect of Vam3 on ATP-induced mouse peritoneal macrophages proliferation（n＝4）

ATP作为比较典型的危险信号，具有许多危险信号的特征，如亲水性强、高细胞内外浓度比、降解迅速及与受体结合的高选择性等。炎症发生进程中，ATP刺激可活化感染或病变组织信号通路［2］。有研究报道，在过敏性哮喘、COPD、急性肺损伤等炎症性疾病动物模型的支气管肺泡灌洗液中，ATP浓度均有明显升高［8－9］。ATP参与炎症过程主要通过活化P2X7介导信号通路，促进细胞因子的合成、分泌。单核巨噬细胞在LPS刺激下，合成34 ku无生物活性的 IL-1β前体（pro-IL-1β），再由转化酶caspase 1剪切转化为成熟的 IL-1β（17.5 ku），而Pro-caspase 1转化为成熟caspase 1则需要ATP活化 P2X7介导［10］。

Fig 6 Effect of Vam3 on ATP-induced intracellular Ca2＋increase in mouse peritonealmacrophages

本研究以LPS预处理的小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，给予ATP刺激，结果显示，LPS预刺激的小鼠腹腔巨噬细胞 IL-1β的分泌在2 h（0、15、30 min，1、2 h）内呈时间依赖性和 ATP（0.5、2.5、5 mmol·L－1）浓度依赖性，遂选取 2.5 mmol·L－1ATP刺激小鼠腹腔巨噬细胞1 h作为刺激条件，结果显示，1、5 mol·L－1Vam3抑制 IL-1β分泌（抑制率分别为78.3%、79.4%），优于阳性对照药KN-62（抑制率为54.3%）。结果显示，LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞在ATP刺激下caspase 1酶活力，随时间（0、15、30 min，1、2 h）呈 S型变化，且在 ATP刺激 1 h时酶活力达最高值，而1、5μmol·L－1Vam3可抑制ATP刺激1 h时的caspase 1酶活力升高。因此，Vam3对ATP参与的caspase 1～IL-1β信号通路显示出一定的阻断作用。研究报道，酪氨酸衍生物KN-62对P2X7有特异性阻断作用，并作为阳性对照药在与P2X7阻断效应相关的体内外研究中得到较广泛应用［11］，因此，本研究选择KN-62为阳性对照，观察Vam3对ATP诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应及对P2X7的影响。

ATP活化P2X类受体后可产生一系列下游炎症效应。Lenertz等［12］研究揭示，P2X7能通过活化MAPKs的ERK1/2和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶复合物，促进巨噬细胞产生ROS，ROS可作为第二信使调节与细胞增殖、分化凋亡及自噬相关的信号转导通路［13］。巨噬细胞在低二价阳离子环境和ATP持续刺激下，转化为非选择性大孔，允许分子质量为900 u大分子跨膜，使得胞外本不通过的物质进入细胞内，而胞内某些物质外流，引起胞内胶体渗透压降低，导致细胞溶解［14］。本研究用ATP作用于LPS预处理的小鼠腹腔巨噬细胞作为观察细胞，结果显示，Vam3在 1、5μmol·L－1浓度下对ATP刺激的ROS产生有抑制作用。以终浓度为1、2、5 mmol·L－1ATP刺激小鼠腹腔巨噬细胞时，2、5 mmol·L－1ATP能抑制细胞增殖，Vam3则能改善此种抑制，且优于阳性对照药KN-62，初步分析Vam3的上述效应可能与其对P2X类受体的阻断作用相关。

细胞外ATP活化P2类受体，诱导细胞内Ca2＋浓度升高是引起细胞反应的第一步［15］。P2X7本身作为P2类受体，为钙离子通道，在巨噬细胞，细胞外ATP主要活化P2X7，致Ca2＋内流，进而激活caspase 1～IL-1β炎性通路，研究结果显示，小鼠腹腔巨噬细胞受ATP刺激后，细胞内Ca2＋浓度20 s左右瞬时升高，而Vam3降低ATP引起的巨噬细胞内Ca2＋升高，初步推测Vam3抑制细胞外ATP诱导的巨噬细胞炎症反应可能与其阻断P2X7参与的caspase 1～IL-1β信号通路有关。

本文初步表明，Vam3抑制细胞外ATP诱导的巨噬细胞炎症反应，主要作用机制可能与其对caspase 1～IL-1β信号通路的影响有关，为进一步研究Vam3对此通路的作用机制提供了研究数据。由于此通路参与了COPD、哮喘、肺纤维化等炎症性疾病发生发展过程，因此本研究将为Vam3在上述疾病中的应用提供实验依据，而Vam3对P2X7的特异性作用机制有待进一步研究。

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