新型Rho激酶抑制剂DL0805-1大鼠体内药代动力学初步研究

武玉洁，王夙博，袁天翊，李人则，焦晓臻，谢 平，方莲花，杜冠华，

1-benzyl-N-（1H-indazol-5-yl）pyrrolidine-3-carboxamide（1-苄基-N-（1-H-吲唑-5-基）吡咯烷-3-甲酰胺，简称 DL0805-1）属于吲唑类化合物（Fig 1）。DL0805-1是由本实验室在高通量药物筛选中发现的、具有Rho激酶活性抑制作用的化合物DL0805［1］经结构优化所获得［2］。体外实验结果表明，DL0805-1具有良好的Rho激酶抑制活性。

Fig 1 Chemical structural formula of DL0805-1

Rho激酶对细胞的分裂、收缩、黏附、迁移、分泌等活动具有重要调节作用［3－5］。Rho激酶的高表达或过度激活与心血管疾病的发生密切相关［6－7］，现在已经成为新药研发的重要靶点。研究表明，吲唑类化合物具有明显的Rho激酶抑制活性［8－9］。我们的前期研究表明，DL0805-1通过多种途径舒张离体大鼠胸主动脉以及肠系膜微动脉。针对DL0805-1具有药理活性强、毒性低、合成工艺相对简单等特点，目前作为心血管保护作用的候选化合物正在深入研究和评价。

本研究通过建立一种HPLC法，对DL0805-1单次尾静脉注射给药后大鼠体内的药动学过程进行考察，得到其药代动力学参数。为DL0805-1进一步药物研发提供其初步的药物代谢动力学实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 DL0805-1由药物所合成室谢平教授提供，纯度＞99%，甲醇、乙腈（ACN）为HPLC级、4-对乙酰氨基酚（4-acetaminophenol，Sigma公司，美国）、乙酸乙酯等为市售分析纯。

Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦科技公司，美国），高速冷冻离心机（Backman，美国），Eppendorf离 心 机 （Eppendorf公 司，德 国 ），NEVAPTM111氮吹仪 （Organomation Associates，美国）。

1.2 实验动物 SPF级SD大鼠，♂，体质量220～240 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012－0001。所有动物自由饮食饮水，自然照明，室温（20～24）℃。

1.3 色谱条件 检测系统：Agilent 1200-DAD；色谱柱：AgilentTC-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；检测波长：235 nm；柱温：35℃；进样量：20μl；运行时间：15 min；流速：1 ml·min－1；流动相：0～5 min：ACN-0.05%H3PO4（15∶85），5.01～11 min：ACN－0.05%H3PO4（25∶75），11.01～15 min：ACN-0.05%H3PO4（15∶85）。

1.4 标准溶液及内标溶液的配制

1.4.1 标准溶液 精密称取10 mg DL0805-1，加入1 ml甲醇充分溶解，配制成10 g·L－1的贮备液，用流动相稀释成不同浓度的标准溶液。

1.4.2 内标溶液 精密称取4-对乙酰氨基酚标准品5 mg，加入1 ml甲醇充分溶解并混匀，配成5 g·L－1的母液，以流动相稀释成50 mg·L－1，作为内标工作液。

1.5 空白血浆样品处理 精密吸取大鼠空白血浆150μl，置于1.5 ml离心管中，加入内标工作液10 μl，再加乙酸乙酯1 ml，涡旋震荡3 min，1.34×104r·min－1离心10 min，取1 ml上清于另一空离心管中，氮气吹干，用100μl流动相复溶，涡旋振荡3 min，1.34×104r·min－1离心 5 min，取上清进样检测。

1.6 方法学确证实验

1.6.1 专属性 比较空白血浆样品（n＝6）与加药血浆样品以及给药后血浆生物样品的色谱图，排除生物样品中的内源性物质对DL0805-1和内标测定的影响。

1.6.2 标准曲线绘制与定量范围确定 取空白血浆，加入系列浓度标准溶液，配制DL0805-1浓度为0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mg·L－1的血浆样品，按“1.5”项下方法处理，在相应的色谱条件下进行测定，重复5次。以DL0805-1峰面积（Ai）与内标峰面积（As）比值（Y）对 DL0805-1的浓度（X）进行线性回归。

1.6.3 回收率

1.6.3.1 提取回收率 配制DL0805-1低、中、高3个浓度（0.625、5、20 mg·L－1）血浆样品，按照“1.5”项下方法处理，进行 HPLC分析，记录峰面积，与对应浓度标准溶液峰面积的比值，重复5次，计算提取回收率。

1.6.3.2 方法回收率 配制DL0805-1浓度为0.625、5和20 mg·L－1的血浆样品，按照“1.5”项下方法处理，进行HPLC分析，记录峰面积并计算Ai／As，带入标准曲线得到DL0805-1的检出量。检出量与加入量的比值即为方法回收率。实验重复5次。

1.6.4 精密度和准确度 配制DL0805-1 3个浓度的血浆样品（0.625、5、20 mg·L－1）。样品在 1 d内进样5次（日内）或连续5 d进样（日间）进行浓度测定，计算精密度与准确度。

1.6.5 稳定性 本实验为了考察DL0805-1的稳定性，对3组血浆样品进行了测定，实验分组如下：（1）配制DL0805-1低、中、高3个浓度的血浆样品，室温放置4 h后处理；（2）血浆样品处理后样品盘放置24 h后测定；（3）血浆样品在－20℃，反复冻融3次（每次冰冻24 h后室温溶解）后处理测定。每组都包含 3个质量浓度（0.625、5、20 mg·L－1）的血浆样品各5个，样品按照“1.5”项下的空白血样处理方法处理。

1.7 血浆生物样品制备与测定 大鼠尾静脉注射给药：按5 mg·kg－1剂量尾静脉注射给予DL0805-1。SD♂大鼠6只，禁食不禁水12 h。分别在给药后 0.033、0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、4、6和8 h眼内眦取血，肝素化管收集血样，5 000 r·min－1、4℃离心10 min，分离得到血浆生物样品，取血浆150μl，按“1.5”项下方法进行样品处理与测定。计算DL0805-1尾静脉注射后血药浓度，绘制血药浓度－时间曲线。

1.8 主要药代动力学参数计算 采用DAS 3.0版数据处理系统对DL0805-1及其代谢产物的血药浓度数据进行处理分析，计算药代动力学参数（非房室模型法）。

2 结果

2.1 专属性考察 在选定的色谱条件下，DL0805-1保留时间约为9.93 min，其代谢产物保留时间约为7.08 min，内标4-对乙酰氨基酚保留时间约为5.83 min，三者可以完全分离；血浆中内源性物质对三者的色谱峰没有干扰（Fig 2 A－C）。

2.2 线性考察 实验结果显示，DL0805-1在0.313～40 mg·L－1浓度范围内，线性回归方程为＾Y＝0.3551 X－0.0067（n＝5），r2＝0.9999，线性范围良好。定量限为0.313 mg·L－1。

2.3 回收率 实验结果表明：DL0805-1在低、中、高3个浓度（0.625、5、20 mg·L－1）的血浆样品提取回收率和方法回收率均在90%以上（Tab 1）。

2.4 精密度和准确度 DL0805-1的日内和日间精密度RSD均小于7%。结果表明该方法准确、可靠，满足未知血浆样品中药物浓度分析的要求（Tab 2）。

2.5 稳定性 实验结果显示：DL0805-1的血浆生物样品在经过不同方法处理后，样品的RSD值均在10%以内（Tab 3）。表明样品在保存和处理过程中均稳定，未发生明显的降解。

Fig 2 Chromatograms of DL0805-1，metabolite of DL0805-1 and IS（4-acetaminophenol）

Tab 1 Recovery for DL0805-1 in rat plasma（n＝5）

Tab 2 Accuracy and inter-／intra-precision for DL0805-1 in rat plasma（n＝5）

Tab 3 Stability of DL0805-1 in rat plasma（RSD%，n＝5）

2.6 生物样品检测 大鼠尾静脉给予DL0805-1后，于不同时间点眼内眦取血，用已建立的HPLC方法测定其血药浓度。结果显示，尾静脉给药后，可以检测到原型药物DL0805-1及其7 min处的色谱峰，初步判定7 min的色谱峰为DL0805-1在体内的代谢产物峰。DL0805-1药 动 学 参 数：AUC（0－t）＝（2.38±0.80）mg·h·L－1，Tmax＝0.03 h，T1／2＝2.34±1.42）h，MRT（0－t）＝（2.00±0.48）h，Cmax＝（3.51±0.44）mg·L－1，CL＝（142.26±53.4）L·min－1·kg－1，代谢产物色谱峰面积相对 DL0805-1定量，得到药动学参数为：AUC（0－t）＝（10.77±1.64）mg·h·L－1，Tmax＝（0.85±0.22）h，T1／2＝（1.27±0.45）h，MRT（0－t）＝（2.11±0.32）h，Cmax＝（3.55±0.22）mg·L－1，CL＝（30.93±5.13）L·min－1·kg－1，药时曲线见 Fig 3。

Fig 3 Plasma concentration-time curves of metabolite（A）and DL0805-1（B）after intravenous injection of DL0805-1（¯x±s，n＝6）

3 讨论

实验结果显示，大鼠尾静脉给予5 mg·kg－1的DL0805-1后，同时检测到原型药物及其代谢产物，DL0805-1的半衰期为（2.34±1.42）h，达峰浓度为（3.51±0.44）mg·L－1，清除率为（142.26±53.4）L·min－1·kg－1。其代谢产物相对DL0805-1的药代参数：半衰期为（1.27±0.45）h，达峰浓度为（3.55±0.22）mg·L－1，清除率为（30.93±5.13）L·min－1·kg－1。可见，DL0805-1在大鼠体内迅速转变成其代谢产物，且DL0805-1在体内滞留时间长，能很好地发挥生物学作用，但其代谢产物是否为活性产物有待进一步研究。

综合以上结果，本研究建立了具有Rho激酶抑制活性的吲唑类新型化合物DL0805-1的体内血药浓度检测方法，经方法学研究确证，本法简便、特异性好，精密度和准确度均满足DL0805-1大鼠药动学研究要求，可用于防治心血管系统疾病候选药物DL0805-1的进一步研究和开发。

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