对乙酰氨基酚SD大鼠毒代动力学研究及P450的影响

郭秋平，杨 威，郭 琳，覃仁安，金若敏

药物性肝损伤（drug induced liver injury，DILI）对患者的健康具有重要影响，DILI会影响药物在临床的使用，甚至药物撤市。对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是临床常用药物，其肝毒性已有大量的报道［1－3］，APAP常用剂量小于2 g·d－1，若大于 4 g·d－1，可致肝损害，大于 10 g·d－1可致死亡。因此，美国食品药品管理局（FDA）要求生产厂家修改药品说明书，标明过量应用APAP可导致肝脏毒性反应。

肝细胞色素P450在药物代谢中起着重要的作用。细胞色素酶P450广泛分布于哺乳动物的组织器官中，其中，肝脏和肠管含量最高［4］。约有20种细胞色素酶P450参与药物的代谢，如果代谢某种药物的酶缺乏或受抑制时，可表现为该药物的血药浓度升高，半衰期延长，导致毒性反应增加［5］。

本研究通过对SD大鼠P450的检测，并结合APAP的毒代动力学结果，分析药物的毒性及体内的蓄积情况，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 SD♀♂大鼠，体质量200～240 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。将大鼠分为4组，即阴性对照组、APAP 189、567 mg·kg－1组以及肝细胞色素P450抑制剂西咪替丁组。每天给药1次，连续14 d，阴性对照组给予超纯水。

1.2 药物及主要试剂 APAP：广州白云山制药股份有限公司白云山何济公制药厂提供，批号：20120801；APAP标准品：中国食品药品检定研究院提供，批号：100018－200408；西咪替丁片：广东台城制药有限公司，批号：20130202。

1.3 方法

1.3.1 毒代动力学研究

1.3.1.1 血浆样品采集和前处理 给药d 1、7、14，于给药0、0.25、0.5、1、2、4、8、12 h眼眶采集 0.5 ml全血，肝素抗凝，2 000×g离心，取上层血浆。取血浆0.2 ml，加入1.2 ml乙醚，涡旋2 min，2 000×g离心，取上层有机相1 ml于另一离心管。40℃水浴，氮气吹干，残渣用100μl纯水溶解，取30 μl进样。

1．3.1.2 方法学验证 高效液相色谱法测定。色谱条件：色谱柱：迪马 diamosil 250 mm×4.6 mm（5μm）。柱温：25℃。流动相：水（1%三乙胺）∶乙腈＝90∶10。流速：1.0 ml·min－1。检测波长：245 nm。进样量：20μl。

1.3.1.2.1 专属性考察 取6只大鼠的空白血浆样品，加入APAP对照品，按照血浆处理方法处理。考察空白血浆样品在APAP出峰时间是否有杂质干扰，方法专属性是否良好。

1.3.1.2.2 线性 配制浓度为1 g·L－1的母液，分别稀释为 1 000、500、250、100、50、25、10 mg·L－1系列浓度的标准溶液。取以上系列浓度各20μl，加入空白血浆，配制成为终浓度 100、50、25、10、5、2.5、1 mg·L－1血浆工作曲线，按血浆样品处理方法处理。

1.3.1.2.3 精密度及准确度试验 精密度用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD%）表示。取0.18 ml空白血浆，加入20μl APAP，配制成终浓度为 100、25、5 mg·L－1的血浆样品，每个浓度5个样品。精密度相对标准差应小于15%，在定量下限附近相对标准差应小于20%。准确度应在85%～115%范围内，在定量下限附近应在80%～120%范围内。

1.3.1.2.4 回收率试验 配制APAP终浓度为5、25、100 mg·L－1的血浆样品，按血浆样品处理方法进行提取。提取后，检测血浆样品中APAP的响应值，回收率计算方法为测定所得APAP的响应值／血浆中已知量APAP的理论值×100%，回收率应在80%～120%范围内。

1.3.1.3 质量控制及样品检测 配制终浓度为5、25、100 mg·L－1的血浆样品，经前处理后平均分布于所有待测样品中，QC样品总数不少于5%。每日随行标准曲线和QC样品。

1.3.2 P450检测 给药14 d后，称取2 g左右的肝脏，加入10 ml匀浆缓冲液或TMS缓冲液，将肝脏剪成细小碎块，用玻璃匀浆器制成20%肝脏匀浆。

1.3.2.1 S9和肝脏微粒体的制备 将肝匀浆液2℃12 000×g高速离心20 min，所得上清液即线粒体后上清液。取适量线粒体后上清液，CaCl2沉淀法制备肝微粒体。每1 ml加入0.1 ml 88 mmol·L－1CaCl2溶液混匀，冰浴 5 min，2℃27 000×g离心15 min。弃上清，所得微粒体用Tris缓冲液清洗，沉淀用磷酸缓冲液重悬。

1.3.2.2 微粒体蛋白含量和细胞色素P450光谱测定 采用考马斯亮蓝试剂盒测定微粒体蛋白含量。光谱法测定细胞色素 P450：测定蛋白含量后，用 Tris缓冲液稀释成10 g·L－1的蛋白悬液。取蛋白悬液0.3 ml，加Tris缓冲液5.7 ml混合，加入适量连二亚硫酸钠，分装于两个比色杯，一为空白杯，另一为样品杯，通入CO，1～2气泡／s，2 min。分别于490及450 nm测定差示光谱。P450计算公式：

1.4 统计学处理 毒代动力学参数采用DAS 2.0软件进行计算，结果应用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料的平均值用x¯±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析（one way ANOVA）。

2 结果

2.1 毒代动力学检测结果

2.1.1 专属性考察结果 对乙酰氨基酚保留时间为5.8 min，血浆中杂质不干扰APAP的测定，该方法具有较高的专属性。

2.1.2 血浆工作曲线 血浆工作曲线在1～100 mg·L－1范围内线性良好，Y＝2．20e4x－4．74e3r2＝0.997；定量下限为1 mg·L－1。

2.1.3 精密度和准确性试验结果 d 1、2、3，日内精密度RSD分别为2.7%～10.7%、2.7%～7.2%、1.2%～8.4%，3 d的日内精密度RSD为1.2%～10.7%，日间精密度RSD 2.2%～3.5%，均小于15%，符合要求。日间准确度0.30%～10.00%。结果见Tab 1、2。

Tab 1 Precision test results of intra day（n＝5）

Tab 2 Precision test results of three days（n＝5）

2.1.4 回收率试验结果 100、25、5 mg·L－1的血浆回收率分别为 98.4%、88.6%、93.8%，回收率为 88.6% ～98.4%，在80%～120%之间，符合要求。

方法学考察结果显示专属性良好，在1～100μg·L－1范围内线性良好，定量下限为1 mg·L－1，精密度、准确度和回收率均达到要求，表明本方法可靠，可用于血浆样品的检测。

2.1.5 样品测定结果 主要药代动力学参数 AUC（0－t）、Cmax、Tmax。其中，AUC（0－t）由梯形法计算得到，Cmax、Tmax均以实测值表示。

APAP 189 mg·kg－1组给药 d 1、7、14，AUC（0－t）分别为（208.6±63.7）、（150.9±102.4）、（214.8±78.5）mg·L－1·h；Cmax分别为（119.0±43.7）、（121.9±92.7）、（90.4±18.7）mg·L－1；Tmax分别为（0.4±0.3）h、（2.2±1.0）h、（0.6±0.7）h。APAP 567 mg·kg－1组给药 d 1、7、14，AUC（0－t）分别为（783.6±163.1）、（982.3±317.9）、（1313.9±189.5）mg·L－1·h；Cmax分别为（161.2±43.4）、（209.0±116.3）、（259.3±51.7）mg·L－1；Tmax分别为（1.5±1.8）h、（1.4±1.4）h、（2.0±0.0）h。

APAP 567 mg·kg－1组给药 d 14，AUC（0－t）、Cmax明显增加，与给药d 1相比，差异有显著性（P＜0.05），提示药物产生了蓄积。

2．2 P450检测结果 给药14 d后，P450抑制剂西咪替丁组P450明显降低，论证了本试验系统合格。对乙酰氨基酚组P450含量降低，与阴性对照组相比，APAP 567 mg·kg－1P450含量降低，差异有显著性，结果见Tab 3。

Tab 3 APAP influence on the content of P450（¯x±s，n＝6）

3 讨论

APAP大鼠毒代动力学研究结果表明，在剂量567 mg·kg－1时，给药14 d后，药物在体内产生了蓄积，对P450的总量也产生了抑制作用，推测P450代谢APAP的功能减弱，使药物在体内产生了蓄积。

目前，虽然APAP药代动力学的研究很明确，但通过本文的研究得出，APAP大剂量使用一段时间后，会产生抑制P450的作用，并引起药物在体内的蓄积，加剧药物毒性。

参考文献：

［1］ Amar P J，Schiff E R.Acetaminophen safety and hepatotoxicitywhere do we go from here［J］？Expert Opin Drug Saf，2007，6（4）：341－55.

［2］ Shayiq R M，Roberts D W，Rothestein K，et al.Repeat exposure to incremental doses of acetaminophen provides protection against acetaminophen induced lethality in mice［J］．Hepatology，1999，29（2）：451－63.

［3］ Fannin RD，Russo M，O′Connell T M，et al.Acetaminophen dosing of humans results in blood transcriptom and metabolome changes consistent with impaired oxidative phosphorylation［J］.Hepatology，2010，51（1）：227－36.

［4］ Koop D R.Oxidative and reductive metabolism by cytochrome P450 2E1［J］.FASEB J，1992，6（2）：724－30.

［5］ Koster U，Speerschneider P，Kerssebaum R，et al.Role of cyctochrome P4502E1 in themetabolism of 1，1，2，2，32 hexafluoropropylmethylether［J］.Drug Metab Dispos，1994，22（5）：667－72.