血清TNF-α升高对糖尿病肾脏脂质积聚的影响研究

张 松，朱 琳，郝 军，郑书深

糖尿病肾病是危害糖尿病病人生命的重要并发症之一［1］，其发生涉及高血流灌注、氧化应激［2］、糖基化末端产物、高血糖［3］、高胰岛素和血脂异常等。有研究发现，糖尿病病人和实验动物的肾组织均出现脂滴积聚，进一步证实脂质积聚在糖尿病肾病的发生中发挥重要作用［4］。固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）是1993年首次从体外培养的人HeLa细胞核抽提物中纯化出来的，该蛋白属于螺旋－环－螺旋－亮氨酸锌指转录因子家族，其在脂质代谢中起着重要调节作用，其高表达往往激活脂质合成相关的酶基因，引起脂肪酸、甘油三酯的合成增多［5］。脂肪分化相关蛋白（adipose differentiation related protein，ADRP）是一种重要的脂滴表面蛋白，也是细胞内脂质积聚的特征性指标［6］。

本课题组前期研究发现，糖尿病大鼠肾小管上皮细胞内出现明显脂滴，脂质代谢的重要转录因子SREBP-1明显上调并伴有脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）的升高；进一步的体外研究又证实，给予人肾小管上皮细胞高糖刺激可上调SREBP-1，进而增加 FASN和乙酰辅酶 A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）的表达［7］，细胞内脂滴增多，提示高糖是糖尿病导致肾小管上皮细胞脂质积聚的原因之一，然而是否还有其他因素也参与其中还未完全阐明。

细胞因子已被证实参与了糖尿病的发生发展［8］，其中肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是其中重要的细胞因子。有研究揭示：TNF-α在肝细胞［9］和皮脂腺细胞中［10］，均可上调SREBP-1表达，导致细胞内脂质积聚。然而，TNF-α是否参与了糖尿病肾脏脂质积聚还未见报道，因此，本课题组拟构建糖尿病小鼠模型，检测血清中TNF-α和肾脏脂质的含量，明确二者之间的关系。对于阐明糖尿病肾脏脂质积聚的机制有重要意义，也为将来的临床治疗提供可靠的靶点和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料 SREBP-1抗体（可同时识别SREBP-1a和SREBP-1c）和 β-actin抗体购自于 Epitomics公司，ADRP抗体购自Santa Cruz公司。链脲佐菌素购自Sigma公司。SP法免疫组织化学试剂盒和DAB购自北京中杉金桥试剂公司。抗小鼠TNF-αELISA试剂盒购自欣博盛公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型构建 动物实验使用CD1小鼠，拟分为以下两组：对照组和糖尿病组，每组7只。糖尿病模型采用腹腔注射链脲佐菌素150 mg·kg－1体重（streptozotocin，STZ，溶于 0.1 mol·L－1枸橼酸盐缓冲液中，pH值4.5），对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液，72 h后，空腹血糖大于16.7 mmol·L－1者确定为1型糖尿病模型。每周检测血糖，剔除血糖恢复的小鼠（2只）。喂养1个月后，水合氯醛麻醉小鼠，眼球摘除取血，并处死动物切取肾脏。全血室温放置约1 h后3 000 r·min－1离心10 min，收集血清；肾脏切取皮质，部分置于中性福尔马林固定，制作石蜡切片，部分液氮速冻后－70℃冰箱保存。

1.2.2 ELISA ELISA方法检测正常和糖尿病小鼠血清的TNF-α水平。从冰箱中取出预包被的酶标板，平衡至室温，空白孔加通用稀释液，标准孔加不同浓度的标准品用于制作标准曲线（0、15.6、31.25、62.5、125、250、500和 1 000 ng·L－1），样品孔加待测的样品100μl，封板胶纸封住反应孔，36℃ 孵育90 min，后续步骤参照说明书进行，最后酶标仪上测量每个孔的OD450值，制作标准曲线，计算待测样品的TNF-α浓度。

1.2.3 免疫组织化学 采用SP法，以PBS代替一抗作阴性对照。石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复后3%过氧化氢室温孵育20 min，血清37℃封闭30 min，一抗（1∶100稀释），37℃孵育 2 h，PBS洗 3次，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素37℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB显色、苏木精复染、分化、返蓝、脱水封片。

1.2.4 Western blot 肾组织块加入10倍体积的冰冷裂解液，经研磨后置于EP管中，4℃、12 000 r·min－1离心20 min，吸取上清，考马斯亮蓝法测定上清液蛋白浓度。每孔加80μg总蛋白，经7.5%SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜；5%BSA封闭，一抗（1∶1 000稀释）4℃过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000稀释）室温孵育2 h；滴加ECL发光试剂，在暗室中压片、显影和定影。条带分析使用Gel-Pro analyzer软件，目的蛋白条带与内参β-actin条带的积分光密度（integrated optical density，IOD）比值作为相对表达量。

1.3 统计学分析 所有数据用¯x±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用t检验，相关分析采用Pearson相关性分析。

2 结果

2．1 糖尿病小鼠血清中TNF-α明显升高 正常CD1小鼠血糖平均值为11.3 mmol·L－1，糖尿病小鼠的血糖平均值为30.78 mmol·L－1。ELISA检测显示正常对照小鼠血清TNF-α浓度平均为31.05 ng·L－1，糖尿病小鼠血清TNF-α浓度平均为240 ng·L－1。相比于正常对照组小鼠，糖尿病小鼠的血清TNF-α升高了大约7.73倍，经t检验统计分析P＜0.05，差异有统计学意义（Fig 1）。

Fig 1 Serum TNF-αconcentration of normal and diabetic mice

2．2 糖尿病小鼠肾脏脂质代谢相关基因SREBP-1和ADRP明显升高 免疫组织化学检测显示，糖尿病小鼠肾脏SREBP-1和ADRP表达主要定位于肾小管上皮细胞的胞质，呈明显的棕黄色，颗粒状，而正常小鼠肾脏仅见少量肾小管上皮细胞有棕黄色颗粒（Fig 2）。

Fig 2 SREBP-1 and ADRP expression in kidney of normal control mice and diabetic mice by immunohistochemistry（×400）

Western blot检测结果见Fig 3，糖尿病小鼠肾脏SREBP-1前体片段、成熟片段和ADRP均明显升高，分别是正常小鼠的2.31倍、1.74倍和1.72倍，经统计分析差异有统计学意义（P＜0.05）。

Fig 3 Expression of SREBP-1 and ADRP in kidney of normal control mice and diabetic mice by Western blot

2．3 小鼠血清TNF-α含量和肾脏ADRP表达呈正相关 采用Pearson相关分析对小鼠血清TNF-α含量和肾脏ADRP表达进行了分析，结果证实在正常小鼠和糖尿病模型小鼠，随着血清中TNF-α含量的增加，肾脏ADRP表达也明显增强，二者经统计分析显示有正相关，相关系数为0.914，P＜0.05，差异有统计学意义（Fig 4）。

3 讨论

糖尿病是一种以血糖升高为临床特征的慢性疾病，并发症的出现严重危害人类健康，其中糖尿病肾病以肾脏高血流灌注、系膜细胞增生肥大、肾小管上皮细胞转分化及肾间质纤维化为特征，可导致肾功能不全，甚至引起患者死亡。研究揭示多种因素参与了糖尿病肾病的发生和发展，例如：高血糖、高血脂、糖基化终末产物、细胞因子、氧化应激。近年来，不断有研究发现，实验动物及糖尿病患者肾脏出现脂质积聚，在系膜细胞和肾小管上皮细胞内出现较多的脂滴。然而，具体的机制还未阐明［11］。

Fig 4 Correlation analysis between serum TNF-α and renal ADRP in mice

大量的研究已证实，免疫及炎症反应在糖尿病肾病发生、发展中发挥重要作用。糖尿病肾病可看作一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病［12］。炎症因子可通过旁分泌和自分泌方式发挥病理生理作用，促进肾脏细胞增生及细胞外基质分泌和聚积、细胞肥大等，并且与疾病晚期肾小管间质纤维化（tubular interstitial fibrosis，TIF）关系密切［13］。然而，炎症因子是否和糖尿病肾脏的脂质代谢异常相关目前尚未见报道。

肿瘤坏死因子有2种亚型：TNF-α和 TNF-β。TNF-α又被称为恶质素，主要由巨噬细胞分泌，其在体内有两种存在形式，一种为跨膜型（tmTNF-α），分子质量为26 ku；另一种为游离型TNF-α，分子质量为17 ku。其中，过多游离型TNF-α会引起一系列的炎性感染及自身免疫性疾病［14］。

本研究揭示糖尿病小鼠血清TNF-α水平明显升高，这和 Hussain等［15］及 Kayal等［16］的研究相似，他们分别在糖尿病患者和实验动物体内发现血清TNF-α的明显升高。本研究还发现糖尿病肾脏脂质代谢调控因子SREBP-1和脂滴标记物ADRP也明显高于正常对照小鼠，提示糖尿病状态下，高TNF-α可能是引起肾脏脂质调控因子升高的因素之一。进一步对血清TNF-α水平和肾脏ADRP之间的表达进行了相关性分析，结果揭示随着血清TNF-α的升高，肾脏表达 ADRP也相应上调。相似地，Endo等［9］在小鼠的研究发现腹腔注射TNF-α后，很快引起了血清游离脂肪酸升高和肝脏的脂质积聚，同时肝脏脂肪酸合成酶和SREBP-1c mRNA水平的表达也明显升高。Choi等［10］在SZ95人皮脂腺细胞的研究也揭示：TNF-α刺激人皮脂腺细胞，增加细胞内脂滴形成，同时伴有脂肪酸合成酶上调和SREBP-1激活，但对PPARs未产生影响。综上所述，血清TNF-α升高可能是导致糖尿病肾小管上皮细胞脂质积聚的因素。然而，涉及这一调控的具体机制还不清楚，有待深入的体外细胞实验研究。

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