跨皮电刺激和外源性rhG-CSF对大鼠胫骨骨折部位Ang-1与bFGF表达及血管再生的影响

马文红，田振军

跨皮电刺激和外源性rhG-CSF对大鼠胫骨骨折部位Ang-1与bFGF表达及血管再生的影响

马文红1，2，田振军1

目的：探讨电刺激及外源性重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF），对大鼠骨折愈合过程中血管再生因子及血管形成的影响。方法：3月龄SD大鼠80只，随机分为对照组、电刺激组、rhG-CSF组和电刺激+rhG-CSF组，每组20只，制备大鼠胫骨闭合性骨折模型，rhG-CSF组和电刺激+rhG-CSF组分别在骨折后3 h皮下注射rhG-CSF，连续注射5天，电刺激组和电刺激+rhG-CSF组分别在骨折后第5天进行跨皮电刺激大鼠小腿，2周取材刺激9天，4、6、8周取材刺激15天，各组分别在2、4、6、8周取材，每次5只，制成脱钙骨切片；用免疫组织化学染色法对骨折部位促血管再生因子Ang-1、bFGF和血管新生因子CD31标记后统计分析，用血管墨汁灌注法对大鼠骨折部位血管形成情况进行观察。结果：免疫组化结果显示，各干预手段均可促进骨折部位Ang-1、bFGF、CD31的表达量，电刺激+rhG-CSF组与电刺激组、rhG-CSF组相比阳性表达均显著升高。墨汁灌注染色结果显示，各干预手段均可促进大鼠骨折部位血管、血管网的形成，加速骨折后的血管重建，尤其以电刺激+rhG-CSF动员组效果更为显著。结论：采用电刺激及外源性rhG-CSF动员均可促进骨折愈合过程中血管再生因子的表达，加速血运重建，且联合作用优于单一因素，为加速骨折愈合提供基础理论依据。

骨折愈合；电刺激；干细胞动员；血管再生；血运重建

微血管在骨折愈合过程中发挥着重要的生物学作用[1]，血运重建是骨折愈合的主要先决条件之一[2]。现已证实，骨折愈合过程中，骨组织细胞主要来自骨折区外的间充质细胞、内皮细胞、血管周围细胞、骨外膜细胞、骨内膜细胞或幼稚细胞和骨髓细胞，它们均通过血管系统带入骨折处[3]。如何促进血管再生、加速骨折愈合，是目前骨折领域研究的热点问题之一。肌肉收缩是血管重建的强有力刺激因素，促进了肢体软组织和骨血液循环，显著增加血流量。rhG-CSF可刺激骨髓内前体细胞，如造血干/祖细胞，基质干细胞、成血管细胞进入外周血液[4]，动员骨髓干细胞促进骨折愈合[5]。由于骨折早期不适合进行运动训练，采用跨皮电刺激骨骼肌收缩可以产生与运动训练相同的生物学效应。目前，尚无文献采用电刺激和骨髓干细胞动员促进骨折愈合的研究报道。墨汁灌注实验方法是测量血管密度变化的经典方法，本文采用跨皮电刺激大鼠小腿骨骼肌收缩，同时给予重组人粒细胞集落因子（rhG-CSF）干预，通过墨汁灌注实验和促血管再生因子Ang-1、bFGF及血管新生因子CD31指标，探讨促进骨折部位早期血管化，加快骨折愈合的进程。积极开展该方面的研究将为骨折临床治疗和康复手段与方法筛选提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及胫骨闭合性骨折模型的建立

雄性3月龄SD大鼠80只，体重280～320 g，分为对照组、电刺激组、rhG-CSF组和电刺激+rhG-CSF组，每组20只。大鼠称重后用20%乌拉坦（5 ml/kg体重）腹腔麻醉，将其右侧胫骨固定于造模支架的铁砧上，中轴上的砝码由30 cm高处垂直自由下落撞击钝性刀片造成大鼠胫骨闭合性骨折。骨折后，拍摄X光片以确定骨折，骨折复位后用夹板和经温水浸泡的石膏绷带进行外固定[6-7]。

1.2 大鼠电刺激及髓干细胞动员剂的剂量与给予方式

大鼠于骨折造模后第5天开始进行跨皮电刺激右小腿[8-9]，采用RM6240多道生理信号采集处理系统，输出电流强度为3 mA，刺激频率为50 Hz，重复次数100次，间隔3 s，每天刺激2次，共10 min，间隔5 min。骨骼肌电刺激从造模后第5天开始，每天在相同时间进行，连续刺激15天。BSCs动员剂选择重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF），剂量为10 μg/kg，在大鼠骨折3 h后皮下注射，10 μg/kg/天，共5天[10]，造模后对照组不作任何处理。

1.3 样品取材及制备方法

造模成功后，分别在第2、4、6、8周取材。大鼠颈椎脱臼处死后，取下右后肢，剥除骨骼外侧软组织，生理盐水清洗后立即置于中性甲醛溶液固定24～48 h，取胫骨中段骨痂组织微波脱钙，脱钙液是10%EDTA（美国Genbiew公司），pH7.5，脱钙3周，脱钙情况用针刺法检验，脱钙完全后纵向剖开常规包埋，5 μm连续切片。墨汁灌注骨组织为40 μm连续切片。

1.3.1 免疫组织化学实验方法 每个指标选取2套切片，免疫组织化学采用SABC法，严格按试剂盒（博士德）说明书步骤进行。切片常规脱蜡至水，PBS冲洗2次，每次3 min；用3%H2O2封闭10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加正常山羊血清封闭液20 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加一抗，多克隆抗体：Ang-1、bFGF、CD31（博士德），抗体稀释浓度分别为1：150、1：120、1：110，4℃过夜，37℃复温，PBS冲洗3次；滴加二抗，37℃，25 min，PBS冲洗4次；滴加SABC，37℃，20 min，PBS冲洗4次；DAB显色，蒸馏水冲洗；苏木素复染（Ang-1未复染）、脱水、透明，中性树胶封片。每次染色设阴性对照染色，PBS取代一抗，其他程序相同。

1.3.2 墨汁灌注实验方法 （1）配制墨汁明胶灌注液。称取明胶6 g溶于100 ml蒸馏水中，用水浴锅加热至40℃孵育，搅拌使其完全溶解后加入10%甲醛10 ml，墨汁（北京一得阁）28 ml，搅拌并用滤纸过滤后置于38℃恒温水浴箱中备用。（2）墨汁明胶液灌注标本的制备。实验大鼠用20%乌拉坦腹腔注射麻醉，固定于手术台，开腹暴露腹主动脉和下腔静脉，将腹主动脉与下腔静脉小心分离2～3 cm，用2个小动脉夹在分离的腹主动脉上、下2端止血后将12号针头自腹主动脉离心插入腹主动脉1.5 cm后，结扎固定，先取下腹主动脉下端动脉夹1 min后取下上端动脉夹。120 mmHg恒压下先灌注36℃肝素生理盐水50 ml冲洗，待腹主动脉的上端流出透明液体时，换用明胶墨汁液36℃灌注，当观察到大鼠四肢、耳朵、眼球等部位变为黑色时停止灌注，结扎腹主动脉插管口上、下2端，并将大鼠放入中性甲醛中固定，4℃冰箱保存24 h后解剖出骨折肢胫骨，放置于10%甲醛溶液中固定3天后切取骨折部位再置于10%甲醛溶液中固定。

1.4 图像采集及数据处理

采用Olympus光学显微镜，高、低倍结合的方法进行观察。墨汁灌注标本，×200拍照后对比分析；免疫组化标本，×400拍照，采用mage-Pro Plus6.0软件进行平均光密度值（MOD）测定与分析。所有数据运用SPSS18.0软件包进行处理，实验结果均以平均数±标准差（X±S）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用T检验。显著性差异选择Plt;0.05和Plt;0.01水平。

2 结果

2.1 大鼠骨折部位Ang-1的表达变化

血管生成素-1（Ang-1）免疫组化阳性结果显示：与rhG-CSF组相比，第2周除对照组外其余各组均显著升高，第4周除对照组外其余各组均显著升高；与电刺激组相比，第2周电刺激+rhG-CSF组显著升高（见图1、表1）。

图1 免疫组织化学法观察各组大鼠骨折部位Ang-1的表达Figure1 Immunohistochemistry rats were observed fracture site Ang-1 expression

表1 rhG-CSF动员和电刺激对骨折大鼠骨组织Ang-1表达的MOD值Table1 rhG-CSF mobilization and passive contraction of the rat bone fractures Ang-1 MOD of expression

2.2 大鼠骨折部位bFGF的表达变化

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）免疫组化阳性结果显示：与rhG-CSF组相比，第2周除对照组外各组表达均显著性升高，造模后第4周除对照组外其余各组表达均显著升高，造模后第6周除对照组外其余各组表达均显著升高；与电刺激组相比，电刺激+rhG-CSF组在第2、4周显著升高（见图2、表2）。

图2 免疫组织化学法观察各组大鼠骨折部位bFGF的表达Figure2 Immunohistochemistry rats were observed expression of bFGF fracture site

表2 rhG-CSF动员和电刺激对骨折大鼠骨组织bFGF表达的MOD值Table2 rhG-CSF mobilization and passive contraction of the rat bone fractures MOD of expression of bFGF

2.3 大鼠骨折部位血管再生观察

2.3.1 不同愈合时期骨痂组织中CD31的免疫组化实验结果血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）免疫组化阳性结果显示：与rhG-CSF组相比，第2、4、6、8周电刺激+rhG-CSF组显著升高，电刺激组第4周显著升高；与电刺激组相比，第2、4、6周电刺激+rhG-CSF组显著升高（见图3、表3）。

表3 rhG-CSF动员和电刺激对骨折大鼠骨组织CD31表达的MOD值Table3 rhG-CSF mobilization and passive contraction of the rat bone fractures MOD of CD31 expression

图3 免疫组织化学法观察各组大鼠骨折部位CD31的表达Figure3 Immunohistochemistry rats were observed expression of CD31 fracture site

2.3.2 不同愈合时期骨折部位血管墨汁灌注形态学观察 血管墨汁灌注形态学观察表明：造模后2周，各组骨折部位均有大量血管再生，但对照组无完整清晰血管，电刺激组、电刺激+rhG-CSF组已有大量完整血管形成，但血管较粗，未形成网络结构；造模后4周，对照组有个别完整血管，其余各组均有大量完整的血管形成，电刺激组、电刺激+rhG-CSF组有血管交通支形成，但血管径大小差别大；造模后6周，对照组血管排列紊乱，局部无血管区，rhG-CSF组可见血管已形成交通支但血管较粗，电刺激组血管生成较丰富，但排列迂曲，分布不均匀，电刺激+rhG-CSF组血管形成丰富，血管网形成排列有规律；造模后8周，对照组血管相互交织、杂乱，呈网状分布无序，rhG-CSF组毛细血管较丰富，血管相互交织，血管排列有序呈网状但管径有差别，电刺激组血管网形成，血管排列有序但血管径大小有差别，电刺激+rhG-CSF组骨皮质可见血管丰富、排列有序，血管径大小基本一致，相互吻合成血管网（见图4）。

图4 大鼠骨折部位血管墨汁灌注染色的显微镜观察结果Figure4 Ink perfusion rat vascular staining fracture site

3 分析与讨论

3.1 电刺激联合rhG-CSF动员对骨折大鼠血管再生因子表达的影响

Ang-1在血管周围尤其是平滑肌细胞周围表达。大量研究证实，人脐静脉成纤维细胞和内皮细胞共培养系统中，加入Ang-1可促进管腔形成[11]；可通过抑制内皮细胞凋亡稳定血管结构防止血管渗漏[12]。研究证实，牵张力产生的机械刺激可导致牵张区中的血管生成，使内源性Ang-1表达水平提高，为骨组织的形成提供了血供保障[13]。bFGF已是公认的内皮细胞增殖和迁移的诱导剂，被誉为血管再生因子。大量文献证实，bFGF不仅促进骨折后的血管再生，还可促进成骨形成[14]，注射bFGF可促进骨折后的血管再生，加速骨折愈合[15]。本实验结果表明，rhG-CSF动员和电刺激均可提高Ang-1、bFGF的释放，尤其是rhG-CSF动员联合电刺激组，骨折后给予一定剂量的rhG-CSF和早期施加适量电刺激干预均可增加血管再生因子，促进血管再生，加速血运重建。

3.2 电刺激联合骨髓干细胞动员对骨折大鼠血管形成的影响

CD31即血小板内皮细胞黏附分子-1是血管内皮细胞标记物，抗CD31可标记新生血管[16]，用免疫组织化学的方法可检测血管新生。本文通过检测CD31表达的阳性内皮细胞，反映大鼠骨折愈合过程中的新生血管表达情况。结果表明，骨髓干细胞动员和电刺激，以及二者双重作用均可促进骨折部位血管生成，电刺激+rhG-CSF动员对大鼠骨折部位血管新生效果更为显著。本实验通过血管墨汁灌注的方法，成功地标注了骨折部位的血管变化情况，电刺激+rhG-CSFrhG-CSF组较早形成完整清晰的血管，血管生成丰富，且血管粗细均匀、排列有序，较早形成血管网，促进骨折后的血运重建。

肌肉收缩是血管重建的强有力刺激因素，骨折后的整复、固定和及时进行功能锻炼可发挥肌肉对血液循环的“水泵”作用。研究证明，缺血肢体局部释放血管再生因子及其受体，促进血管新生和侧支循环的形成[17]，但这些血管再生因子不能满足损伤部位的血运重建。大量研究证明，运动训练可以促进缺血肢体的血管再生[18]、局部血流量的增大、毛细血管密度增加等[19]。骨骼肌电刺激促使骨折部位肌肉被动收缩，不仅可以促进血管再生因子的表达，同时加速血流量，加快骨折后血管再生因子的募集，加速骨折血运的重建，促进骨折愈。利用骨髓干细胞治疗损伤的方法有骨髓干细胞移植和骨髓动员2种。二者相比，动员自体骨髓干细胞向损伤区趋化、归巢并分化，促进血管、组织再生，更符合机体的反应性修复，方便、无创、实用性强[20]。

本实验采用重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员的方法来动员大鼠自体干细胞，促进骨折后骨髓干细胞（MSCs）向骨外周血迁移，增加外周血中的造血干细胞/内皮祖细胞，为血管重塑募集更多的血管再生因子，促进血管新生，加速骨折愈合。采用表皮骨骼肌电刺激，促使骨骼肌被动收缩，加速局部血液循环，促进血管再生与重建，通过骨骼肌收缩改善骨折周围力学环境、化学环境，促进肢体软组织和骨内血液循环，增加血流量，营养物质、氧气和修复因子也被更多地带入受损部位，同时组织代谢产物和组织坏死细胞能及时运输出体外，为组织修复提供修复因子，改善损伤部位的外环境。

4 结 论

电刺激和rhG-CSF动员均可促进血管再生因子Ang-1、bFGF的释放，促进完整血管形成、血管有序排列、生成丰富，加速血管重建，且电刺激+rhG-CSF组在血管生成的各个阶段效果均优于单一干预手段。电刺激+rhG-CSF动员在促进血管再生加速骨折后的血运重建有显著疗效，为加速骨折愈合提供了基础理论依据，具有理想的临床应用价值。

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Effects of Electrical Stimulation and Exogenous rhG-CSF on the Expressions of Ang-1，bFGF and Angiogenesis inTibiaFractureSiteinRats

MA Wenhong1，2，TIAN Zhenjun1
（1.School of PE，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China；2.School of PE，Xinjiang Normal University，Urumqi 830054，China）

Objective：Investigate the effects of electrical stimulation and exogenous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor（rhG-CSF）on the angiogenesis factor responsible for vascular remodeling during fracture healing in rats.Methods：80 three-month-old SD rats were randomly assigned to 1）the control group，2）electrical stimulation group，3）rhG-CSF group，and 4）electrical stimulation+rhG-CSF group.The rhG-CSF group and electrical stimulation+rhG-CSF group were treated with 5 days continuous subcutaneous rhG-CSF injection 3 hours after fracture.The electrical stimulation group and electrical stimulation+rhG-CSF group were treated with electrical stimulation 5 days after fracture.The 2，4，6，8 week groups were stimulated for 9，15，15，and 15 days，respectively.Each group was sacrificed at 2，4，6，and 8 weeks with 5 rats per group.Bone slices were decalcified，then immunohistochem⁃ical staining was performed to examine the effects on the expressions of the angiogenesis factor Ang-1，bFGF and angiogenic factor CD31 at the fracture site.Ink perfusion was then performed to visualize vasculature formation at the fracture site.Results：The results of immunohistochemistry indicated that all the in⁃tervention can promote the expression of Ang-1，bFGF and CD31 at the fracture site.Compare to electrical stimulation group and rhG-CSF group，electrical stimulation+rhG-CSF group can significantly induce the expression of these three factors.Ink perfusion staining showed that the intervention could promote vascular network formation and accelerate revascularization at the fracture site.In particular，electrical stimulation combined with rhG-CSF mobilization ef⁃fect was even more significant.Conclusions：Electrical stimulation and exogenous rhG-CSF mobilization could promote fracture healing angiogenesis factor which lead to accelerated revascularization.Fracture healing can be accelerated to a further extend by combining these interventions.This result provides theo⁃retical basis for methods that accelerated fracture healing.

fracture healing；electrical stimulation；stem cell mobilization；angiogenesis；revascularization

G 804.2

A

1005-0000（2014）01-066-05

2013-09-29；

2013-12-19；录用日期：2013-12-20

陕西师范大学“211工程”重点建设学科——运动生物学学科建设项目（项目编号：2010.11）

马文红（1980-），女，新疆昌吉人，在读博士研究生，研究方向为运动血管生物学；通信作者：田振军（1965-），男，陕西绥德人，教授，研究方向为运动心血管与骨骼肌适应。

1.陕西师范大学体育学院，陕西西安710062；2.新疆师范大学体育学院，新疆乌鲁木齐830054。