单卵裂期胚胎移植在体外受精－胚胎移植中的临床结局

刘琨，张学红，李红星，胡俊平，薛石龙，刘梦伊，景原雪，宋德潇，孙亮，王乃辉

（兰州大学第一医院生殖医学专科医院，兰州 730000）

多胎妊娠是现代辅助生殖技术（ART）中最常见的并发症之一，由多胎妊娠导致相应的产科及新生儿科的并发症也明显增多，增加了患者及社会的经济负担。Baruffi等［1］对1995～2008年相关文献资料汇总并进行Meta分析，新鲜移植周期双胚移植组的继续妊娠率是单胚移植组的1．64～2．60倍，活产率是单胚移植组的1．44～2．42倍。但妊娠胎数与不良妊娠结局有着明显的相关性，多胎妊娠时母亲并发症如妊娠期心脏病、羊水栓塞、子痫前期、妊娠期糖尿病和产后出血的发生率均明显增高，不仅延长住院时间，同时产科介入、子宫切除及输血治疗的可能性也大大增加［2］。因此，为减少多胎妊娠的发生，提高优生优育的水平，最佳的办法是进行选择性单胚胎移植。现在普遍认为单胚胎移植是一种简单、有效地降低多胎妊娠及围产期母婴并发症风险的方法。

资料和方法

一、研究对象

本研究回顾性分析2012年1～12月在我院实施体外受精（IVF）后第3天（D3）单卵裂期胚胎移植助孕的患者，共172个周期纳入研究。入选患者平均年龄（31．78±5．67）岁，不育年限（5．37±3．92）年。D3移植卵裂期胚胎1枚，均采用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）长方案进行控制性超排卵。

二、方法

超排卵方案详见相关文献［3］。卵母细胞取出后培养3～6h进行授精，第2天早晨观察受精情况，并将每个受精卵分别移入预平衡好的G1培养液（Vitrolife，瑞典）微滴中。体外受精第3天，根据胚胎形态学参数［4］进行胚胎评分后实施单卵裂期胚胎移植。本实验获得兰州大学第一医院伦理委员会的批准，所有患者均知情同意。

对纳入统计标准的172例患者资料进行分组：（1）按发病原因分为原发不育组和继发不育组。（2）以取卵后第3天移植卵裂期胚胎质量分为A组：卵裂球数≤5；B组：卵裂球数6～7；C组：卵裂球数≥8。三组胚胎碎片均＜20%。（3）主动性单卵裂期胚胎移植组（I组），即有两个以上优质卵裂期胚胎而选择仅移植一枚胚胎；被动性单卵裂期胚胎移植组（Ⅱ组），即仅有一枚可移植卵裂期胚胎而不得不选择单胚胎移植。（4）被动性单卵裂期胚胎移植组再按年龄分为≤30岁、31～35岁、36～39岁、≥40岁四组。

三、统计学方法

采用SPSS17．0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验和One-way ANOVA方差分析，计数资料采用χ2检验，P＜0．05认为差异有统计学意义。

结 果

一、根据病因分组单卵裂期胚胎移植患者的一般临床资料及结局

原发不育组113个周期，临床妊娠38例；继发不育组59个周期，临床妊娠14例。无一例多胎妊娠，均为单胎妊娠。继发不育组女方年龄显著高于原发不育组（P＜0．01），胚胎 MⅡ卵率、受精率、卵裂率、移植胚胎的细胞数、评级、移植日内膜等均无统计学差异，原发不育组临床种植率（妊娠率）高于继发不育组，但无统计学差异（P＞0．05）（表1）。

二、根据移植胚胎情况分组行单卵裂期胚胎移植患者的一般临床资料及结局

按移植卵裂期胚胎所含细胞数分组，A组63个周期，B组43个周期，C组66个周期，临床妊娠率（种植率）依次为11．11%、23．26%、53．03%，A、B组与C组存在显著性差异（P＜0．01）。A、B组与C组患者的年龄、不育年限、MⅡ卵率、受精率亦存在显著性差异（P＜0．01）。A组与C组（P＜0．05）、B组与C组（P＜0．01）卵裂率有显著性差异，三组间移植卵裂期胚胎的细胞数和胚胎评级均有显著性差异（P＜0．01）（表2）。

表1 不同病因组行单卵裂期胚胎移植患者的一般临床资料与结局［（±s），n（%）］

表1 不同病因组行单卵裂期胚胎移植患者的一般临床资料与结局［（±s），n（%）］

注：与继发不育组比较，＊P＜0．01

卵率 受精率原发不育 113 30．03±4．51＊ 5．62±4．12 7．68±5．44 1139／1230（92．60） 965／1139（84．72）组 别 例数 年龄（岁） 不育年限（年） 基础FSH（U／L） MⅡ继发不育 59 34．49±5．78 4．91±3．49 8．05±3．72 434／463（93．74） 373／434（85．94）组 别 例数 卵裂率 ET日内膜（cm） 细胞数（个） 胚胎评级（级） 妊娠率（种植率）原发不育 113 859／965（89．02） 1．09±0．22 6．43±1．90 2．59±0．63 38／113（33．63）继发不育 59 335／373（89．81） 1．13±0．26 6．07±1．76 2．70±0．61 14／59（23．73）

表2 根据移植胚胎情况分组行单卵裂期胚胎移植患者的一般临床资料及结局［（±s），n（%）］

表2 根据移植胚胎情况分组行单卵裂期胚胎移植患者的一般临床资料及结局［（±s），n（%）］

注：与C组比较，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05；三组间两两比较，＃P＜0．01

组 别 例数 年龄（岁） 不育年限（年） 基础FSH（U／L） MⅡ卵率 受精率A组 63 34．29±5．40＊ 6．10±4．37＊ 8．36±3．70 296／348（85．06）＊ 213／296（71．96）＊B组 43 32．09±5．43＊ 6．15±4．69＊ 8．13±4．40 244／282（86．52）＊ 185／244（75．82）＊C组 66 28．76±3．55 4．17±2．37 7．11±6．01 1 033／1 063（97．18） 940／1 033（91．00）组 别 例数 卵裂率 ET日内膜（cm） 细胞数＃（个） 胚胎评级＃（级） 妊娠率（种植率）A组 63 185／213（86．85）＊＊ 1．10±0．24 4．20±0．75 3．16±0．41 7／63（11．11）＊B组 43 148／185（80．00）＊ 1．07±0．22 6．47±0．50 2．84±0．28 10／43（23．26）＊C组 66 861／940（91．60） 1．13±0．25 8．08±0．27 1．99±0．32 35／66（53．03）

三、根据行单卵裂期胚胎移植的意愿性分组患者的一般临床资料及结局

主动性单卵裂期胚胎移植组患者年龄、MⅡ卵率、受精率、卵裂率、移植胚胎的细胞数、评级均显著高于被动性单卵裂期胚胎移植组（P＜0．01），不育年限亦有显著性差异（P＜0．05）。117例被动性单卵裂期胚胎移植组（Ⅱ组）中仅22例妊娠，妊娠率18．8%；55例患者实施主动性单卵裂期胚胎移植（Ⅰ组），临床妊娠30例，临床妊娠率（种植率）54．55%，显著高于前者（P＜0．01）（表3）。

117例被动性单卵裂期胚胎移植组中，≤30岁与（36～39）岁、≥40岁，以及（31～35）岁与≥40岁平均获卵数有显著性差异（P＜0．01），（31～35）岁与（36～39）岁平均获卵数亦有显著性差异（P＜0．05）岁。（36～39）岁组与其他3组 MⅡ卵率有显著性差异（P＜0．05）。四组间受精率、卵裂率、内膜厚度、移植胚胎质量、妊娠率等均无显著性差异（P＞0．05）（表4）。

主动性单卵裂期胚胎移植组中患者年龄在36岁以上的只有1例，未妊娠。年龄≤30岁和（31～35）岁的患者分别有43例、12例，平均获卵数分别为（19．65±5．74）个、（20．73±5．69）个，临床妊娠率 （种 植 率）依 次 为 58．14% （25／43）、41．67%（5／12）。

表3 根据行单卵裂期胚胎移植意愿性分组患者的一般临床资料和结局［（±s），n（%）］

表3 根据行单卵裂期胚胎移植意愿性分组患者的一般临床资料和结局［（±s），n（%）］

注：与Ⅱ组比较，＊P＜0．01，＊＊P＜0．05

组 别 例数 年龄（岁） 不育年限（年） 基础FSH（U／L） MⅡ卵率 受精率Ⅰ组 55 33．33±5．23＊ 5．87±4．33＊＊ 8．67±5．70 1 069／1 092（97．89）＊982／1 069（91．86）＊Ⅱ组 117 27．78±3．50 4．31±2．58 7．03±1．29 504／601（83．86） 356／504（70．63）组 别 例数 卵裂率 ET日内膜（cm） 细胞数（个） 胚胎评级（级） 妊娠率（种植率）Ⅰ组 55 894／982（91．04）＊ 1．09±0．24 7．81±0．92＊ 1．99±0．44＊ 30／55（54．55）＊Ⅱ组 117 300／356（84．27） 1．13±0．24 5．55±1．60 2．93±0．45 22／117（18．80）

表4 不同年龄段被动性单卵裂期胚胎移植患者的一般临床资料和结局［（±s），n（%）］

表4 不同年龄段被动性单卵裂期胚胎移植患者的一般临床资料和结局［（±s），n（%）］

注：与（36～39）岁、≥40岁组比较，＊P＜0．01；与≥40岁组比较，＊＊P＜0．01；与（36～39）岁组比较，＃P＜0．05；与≤30岁、（31～35）岁组比较，△P＜0．01；与≥40岁组比较，▲P＜0．05

卵率 受精率 卵裂率≤30岁 41 6．37±4．23＊ 225／261（86．21） 160／225（71．11） 137／160（85．63）组 别 例数 平均获卵数（个） MⅡ31～35岁 39 5．95±3．87＊＊＃ 198／232（85．34） 143／198（72．22） 121／143（84．62）36～39岁 18 3．22±3．46 39／58（67．24）△▲ 27／39（69．23） 21／27（77．78）≥40岁 19 2．63±2．03 42／50（84．00） 26／42（61．90） 21／26（80．77）组 别 例数 ET日内膜（cm） 细胞数（个） 胚胎评级（级） 妊娠率（种植率）≤30岁 41 1．08±0．27 5．76±1．79 2．94±0．52 8／41（19．51）19 1．12±0．27 5．00±1．53 2．92±0．38 0 31～35岁 39 1．09±0．20 5．81±1．56 2．90±0．48 11／39（28．21）36～39岁 18 1．09±0．23 5．12±1．05 3．00±0．30 3／18（16．67）≥40岁

讨 论

近年来，辅助生殖技术被广泛应用于不孕症患者的治疗，通过移植多个胚胎来提高妊娠率曾是多数生殖中心普遍接受的观点。选择移植2～3枚胚胎，最终多胎率在20%～35%，远高于自然妊娠的多胎发生率［5］。多胎对孕妇及婴儿造成了一系列问题，如不仅增加了产妇高血压、未足月产和早产的概率［6］，而且多胎低出生体重的概率比单胎高8倍，多胎婴儿出现脑瘫概率比单胎高4倍［7］。现在普遍认为解决多胎的最好办法是单个胚胎移植［8－9］。本中心总结了172个单卵裂期胚胎移植周期，发现无论是主动性单卵裂期胚胎移植还是被动性单卵裂期胚胎移植，妊娠结局主要与移植胚胎所含细胞数及胚胎评级有关，其次与女性年龄、不育年限相关。在D3移植卵裂期胚胎所含细胞数和评级相同的情况下，原发不育组的妊娠率略高于继发不育组，但无统计学差异，考虑可能与原发不育组患者相对年轻，性腺轴调控功能、胚胎与子宫内膜的同步性更佳［10］以及年龄相关的胚胎非整倍体和线粒体改变等有关［11］。另外，目前对于卵裂期仅有一枚胚胎可供移植者该如何决定移植方案及其妊娠结局的预计的研究很少，也是临床医生及胚胎研究者经常遇到的困惑之一，对此类患者实施囊胚培养势必增加移植取消几率，减少其妊娠机会。本研究中显示被动性单卵裂期胚胎移植患者主要包括四类人群：（1）高龄；（2）卵巢早衰；（3）精子或卵母细胞因素导致的受精率或正常受精率降低；（4）受精、卵裂均正常，但只有一枚可移植胚胎，其余均为4级胚胎。其中前3类患者仍有可能获得优质胚胎，而对于第4类患者即使有1～2枚可移植胚胎，但往往质量不好，妊娠结局差。本研究中有9例患者获卵数超过10枚，受精、卵裂均正常，但D3只有一枚卵裂期胚胎可行移植，其中仅1例移植胚胎为7细胞3级者妊娠（11．11%），其他8例患者的胚胎细胞数为4～6，均未获得妊娠。有研究认为这种现象与促排卵方案［12］、培养环境［13］、卵母细胞／精子自身因素［14］等有关，因此，有必要对此类患者予以进一步研究，增加其受孕机会。

随着体外受精－胚胎移植（IVF-ET）等辅助生殖技术广泛开展，如何既获得高种植潜能的胚胎以提高临床妊娠率，又能减少多胎妊娠的发生率是其中的一个关键问题。因此，正确判断和选择具有良好发育潜能和高种植率的胚胎用于移植成为胚胎学研究的焦点。目前多数中心在受精后第3天8细胞以上优质胚胎超过3枚时，选择在第5天（D5）实施单囊胚移植，临床妊娠率达40%～70%，双胎率3%左右［15－16］，本研究中胚胎移植均选择在受精后第3天的卵裂期胚胎，其中主动性单卵裂期胚移植临床妊娠率为54．55%，无一例多胎风险，表明D3卵裂期单胚胎移植也能获得良好的妊娠结局。对117例被动性单卵裂期胚胎移植患者分析显示，女方年龄超过36岁，平均获卵数明显减少，成熟卵数也降低。40岁以上组的MⅡ卵率为84%，与35岁以下患者的MⅡ卵率接近，妊娠结局的差异考虑与获卵数降低有关。因此，对高龄女性即使移植胚胎形态学观察质量和年轻组没有差别，但妊娠率有降低趋势，在主动性单卵裂期胚胎移植组可见到同样的妊娠率下降趋势，但没有统计学差异。其次对于获卵数不多、胚胎整体质量不佳者囊胚培养风险增加，因此在D3进行单卵裂期胚胎移植可能是更佳的选择。

综上所述，我们认为对于有足够优势胚胎者，主动实施单卵裂期胚胎移植也能获得同单囊胚移植同样满意的妊娠结局，可降低多胎妊娠及其可能产生的母婴危害。对于只有一枚可选择胚胎的患者，在D3天实施卵裂期胚胎移植时，临床妊娠与移植的卵裂期胚胎质量有关。

［1］ Baruffi RL，Mauri AL，Petersen CG，et al．Single embryo transfer reduces clinical pregnancy rates and live births in fresh IVF and Intracytoplasmic Sperm Injection（ICSI）cycles：a meta-analysis［J］．Reprod Biol Endocrinol，2009，7：36．

［2］ Walker M，Murphy KE，Pan S，et al．Adverse maternal outcomes in multifetal pregnancies［J］．BJOG，2004，111：1294-1296．

［3］ 刘琨，任育宏，张学红，等 ．应用荧光原位杂交技术进行胚胎种植前遗传学诊断的临床分析［J］．癌变·畸变·突变，2010，22：383-385．

［4］ Brinsden PR著 ．全松 译 ．体外受精与辅助生殖［M］（第3版）．人民卫生出版社，2009：233-234．

［5］ Abha M，Siriol G，Siladitya B．Global variations in the uptake of single embryo transfer［J］．Hum Reprod Update，2011，17：107-120．

［6］ Sullivan EA，Wang YA，Hay Ward I，et al．Single embryo transfer reduces the risk of perinatal mortality，apopulation study［J］．Hum Reprod，2012，27：3609-3615．

［7］ 庄广伦 ．必须重视辅助生殖技术可能风险的防治［J］．国际生殖健康／计划生育杂志，2011，30：263-264，271．

［8］ Antonina S，Karin K，Ann TK，et al．Obstetric outcome after in vitro fertilization with single or double embryo transfer［J］．Hum Reprod，2011，26：442-450．

［9］ Niinimäki M，Suikkari AM，Mäkinen S，et al．Elective singleembryo transfer in women aged 40-44years ［J］．Hum Reprod，2013，28：331-335．

［10］ Diana Valbuena，Melinda Jasper，JoséRemohí，et al．Ovarian stimulation and endometrial receptivity［J］．Hum Reprod，1999，14：107-111．

［11］ Grøndahl ML，Andersen CY，Bogstad J，et al．Gene expression profiles of single human mature oocytes in relation to age［J］．Hum Reprod，2010，25：957-968．

［12］ Ziebe S，Lundin K，Janssens R，et al．Influence of ovarian stimulation with HP-hMG or recombinant FSH on embryo quality parametersin patients undergoing IVF［J］．Hum Reprod，2007，22：2404-2413．

［13］ Stigliani S，Anserini P，Venturini PL，et al．Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation［J］．Hum Reprod，2013，28：2652-2660．

［14］ Magli MC，Gianaroli L，Ferraretti AP，et al．Embryo morphoIogy and development are dependent on the chromosomal complement［J］．Fertil Steril，2007，87：534-541．

［15］ 张波，冯贵雪，周红，等 ．冻融周期单囊胚移植的影响因素［J］．生殖医学杂志，2011，20：437-442．

［16］ 金海霞，孙莹璞 ．囊胚移植从双胚胎移植到单胚胎移植的经验体会［J］．生殖医学杂志，2012，21：125-128．