补充山菠菜多糖对长时间大强度运动大鼠肝SMAD4、铁调素和肾促红细胞生成素表达的影响

王金霞 刘玉倩 常丽新 王羽

1河北师范大学体育学院（石家庄 050024）2河北理工大学化工与生物技术学院

机体铁贮备不足直接影响运动机体的O2运输和能量代谢，诱发运动性疲劳，导致运动耐力下降［1］。由于运动常伴有红血球溶解、血尿、出汗、胃肠道出血等现象，长时间大强度运动极易诱发运动员（尤其是女运动员）机体铁缺乏症（iron deficiency，ID）［2-4］。有报道，从事不同运动项目的女运动员ID的发病率为25%～36%，赛季期间发病率高达70%［5，6］。 铁缺乏症如得不到有效治疗，会导致缺铁性贫血（iron deficiency anaemia，IDA）［7］。铁调素（hepcidin）是一种富含半胱氨酸的肝脏抗菌多肽，对机体铁稳态起着关键性的负调控作用［8］。研究表明，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）-SMADs是介导hepcidin表达的主要信号通路，SMAD4是通路中关键的信号传导因子，可影响hepcidin转录［9，10］。 山菠菜提取物——山菠菜多糖（Atriplex hortensis polysaccharide，AHP）具有补血止血的功效，对ID有较好的辅助治疗效果，但其治疗机制尚不明了。本研究采用长时间大强度运动大鼠模型，观察补充山菠菜多糖能否作为hepcidin抑制剂对大鼠肝SMAD4起调控作用，从而改善运动铁缺乏症大鼠的机体铁状态，进一步探讨山菠菜多糖改善运动铁缺乏症的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及运动方案

4周龄雄性Wistar大鼠24只，体重（130±10）g，购自河北医科大学实验动物饲养中心，动物生产许可证号：SCXK（冀）2008-1-003。所有动物均无训练史。每日自然光照射，自由进食饮水，室温22～25℃，湿度50%±5%，分笼喂养。随机分为3组：对照组（control group，CG组）、运动组（exercise group，EG组）和运动+多糖组（exercise+polysaccharide，EP组）。EG组和EP组大鼠进行5周跑台训练，速度25 m/min，坡度为0。每周训练6天，周日休息。前2周为运动性适应阶段，每天训练1次，后3周每天训练2次，实验第1天大鼠训练1 min，以后以每次2 min的速度递增，最后一天训练95 min。

1.2 药品配备及动物给药

将清洗干净的山菠菜叶子烘干后粉碎，索氏提取器脱脂4～6 h，60℃烘干备用。称取脱脂后的山菠菜于锥形瓶中，以液料比为28∶1（ml/g）加入pH为4.6的蒸馏水，低火微波提取4.5 min，过滤，大孔树脂进行动态吸附解析滤液，可分离纯化粗多糖溶液，浓缩，醇沉，过滤，烘干沉淀，得粗多糖。以上提纯工作由河北理工大学化工与生物技术学院协助完成。将山菠菜提取物置于-20℃冰箱保存，提取物多糖含量约为43%。使用前按照100 mg/kg的剂量将提取物配成悬浊液。为防止药品过期沉淀，每天配置1次。于实验第3周开始对EP组大鼠每天下午6：00灌胃1次，每次2 ml，CG组和EG组给予同等剂量的生理盐水。

1.3 取材

于5周末运动后24 h取材。所有大鼠均采用1%的戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，打开胸腔，心尖取血。将血液放入加有促凝剂的促凝管中离心以备血清铁测定。用DEPC配置的生理盐水于大鼠升主动脉迅速灌流，迅速剪取大鼠肾脏和肝脏，装入EP管，投入液氮以备促红细胞生成素 （erthopoietin，EPO）、SMAD4和hepcidin mRNA蛋白测定。

1.4 采用RT-PCR法检测大鼠肾脏EPO、肝脏SMAD4和hepcidin mRNA表达

1.4.1 cDNA合成

取肝脏、肾脏样品组织各约100 mg，加入1 ml Trizol Reagent（Invitrogen，USA），在玻璃匀浆器中进行冰上匀浆，在磨碎组织中加入200 μl氯仿，震荡离心后提取上清液，加入异丙醇析出RNA沉淀，用75%的乙醇溶剂清洗两遍沉淀后的RNA，晾干后加入灭活的DEPC水测定RNA浓度。将提取的RNA放入反转录反应体系，放入PCR仪中进行反转录 （70℃ 10 min，42℃ 1 h、75℃ 15 min），合成cDNA。引物序列参照Thorsten Bramey等的研究［11，12］设计，见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4.2 cDNA扩增

反转录产物在冰上配制PCR反应液，PCR仪器中进行扩增反应。 95℃ 4 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃1 min（34个循环）。1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Fujifilm Las-4000）分析与β-actin吸光值的比值。

1.5 大鼠血清铁状态的测定

血清铁 （Serum iron，SI）、 血清未饱和结合铁（serum unsaturated iron binding capacity，UIBC）和血清总铁结合力 （serum total iron binding capacity，TIBC）试剂盒由南京建成生物科技公司提供，检测方法严格按照说明书的步骤进行操作。

1.6 统计学分析

所有数据全部采用SPSS18.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），所得结果用表示，显著性水平为P<0.05，非常显著性水平为P<0.01。

图1 RT-PCR检测各组大鼠EPO、SMAD4和hepcidin mRNA表达

2 结果

2.1 大鼠肾脏EPO、肝SMAD4和hepcidin mRNA表达

图1显示，运动组EPO表达（0.93±0.20）显著低于对照组（1.41±0.35）（P<0.05），肝SMAD4 mRNA（0.94±0.01）和hepcidin mRNA表达（1.04±0.04）显著高于对照组（SMAD4：0.75±0.10，hepcidin：0.80±0.10）（P<0.01）。 运动+多糖组EPO表达（2.35±0.50）显著高于对照组和运动组 （P<0.01），肝SMAD4 mRNA（0.65±0.10）和hepcidin mRNA表达（0.66±0.12）显著低于对照组和运动组（P<0.05，P<0.01）。

2.2 大鼠血清铁状态

表2显示，运动组大鼠血清铁、未饱和铁结合力和血清总铁结合力显著低于对照组 （P<0.01）；运动+多糖组大鼠血清铁、未饱和结合铁和血清总铁结合力显著低于对照组（P<0.05）而显著高于运动组（P<0.05）。

表2 各组大鼠血清铁状态比较

3 讨论

3.1 补充山菠菜多糖对长时间大强度运动大鼠SMAD4和hepcidin mRNA表达的影响

铁调素（hepcidin）是机体铁状态的重要负调节因子，SMAD4是介导hepcidin调控通路中的关键上游信号因子。1995年Sekelsky等在黑腹果蝇体内发现sma（mothers against dpp）的同源蛋白mad参与转化生长因子-β（transfor growth beta，TGF-β）的信号传导，后陆续在爪蟾等体内发现sma，之后mad和sma被统一命名为Smad蛋白家族［13］。 Smad1-9负责将TGF-β/Smads信号从细胞膜传导至细胞核并参与TGF-β靶基因的调节。SMAD4是Smads蛋白家族的关键蛋白，由552个氨基酸残基编码而成，含有11个外显子和10个内含子。SMAD4与其他Smad不同，拥有独立的SMAD4活性区，几乎可以与所有活化受体调节型smads蛋白结合，形成低聚体复合物并参与信号传导［14］。有研究证实，小鼠敲除肝脏SMAD4基因后，hepcidin表达降低，并表现出严重的肝铁沉积［15］；骨形态发生蛋白（Bone morphgenetic proteins，BMPS）属于TGF-β超家族成员［16］。研究证实，BMP-SMADs是调控肝脏hepcidin表达的主要信号通路，BMP2、BMP4、BMP6和BMP9均被证实能调控hepcidin转录［17-20］。本实验室前期研究表明，长时间大强度运动后，BMP6 mRNA表达增加BMP6上调hepcidin表达，机体铁稳态遭到破坏［21］。 BMP6对BMP-SMADs通路信号的级联反应起着关键性作用，BMP6与BMP II型受体BMPR-II先行结合，诱导BMP I型受体BMPR-I磷酸化，并与其形成复合物，这些复合物转而促使SMADs（Smads1/5/8）进一步磷酸化，受体调节的SMADs（Smad1/5/8）与SMAD4形成异源复合物转位至细胞核，影响hepcidin转录［22］。体内试验证实，BMP6 mRNA表达同时受铁的调控，铁能够诱导BMP6 mRNA表达和smad5磷酸化［23-25］。Hepcidin主要通过抑制小肠铁吸收、巨噬细胞铁释放和肝铁动员负调控机体铁稳态。当前，hepcidin已成为衡量运动员运动后尿液铁状态和血清铁状态的敏感生物指标之一［26，27］。

本实验中，长时间大强度运动后，大鼠SMAD4和hepcidin mRNA表达量与对照组相比显著增加，机体铁状态明显下降；补充多糖后，运动+多糖组SMAD4和hepcidin mRNA表达量与运动组相比显著下降，机体铁状态明显升高。结果表明长时间大强度运动过程中，hepcidin表达上调，机体铁输出量增加，诱发机体铁缺乏；补充山菠菜多糖能够抑制SMAD4表达，从而下调hepcidin水平，改善机体缺铁状态。

3.2 补充山菠菜多糖对长时间大强度运动大鼠EPO表达的影响

EPO是主要由肾脏分泌的激素样物质，后发现肝脏也可分泌。EPO可上调骨髓幼红细胞中转铁蛋白受体（TfR1）表达，增强细胞摄铁能力，促进红细胞中Hb合成，降低血清转铁蛋白饱和度，被广泛应用于贫血的临床治疗。本实验结果表明，长时间大强度运动后大鼠肾脏EPO表达、血清铁含量较对照组显著降低，hepcidin表达量显著增加；补充山菠菜多糖后大鼠肾脏EPO表达量、血清铁含量与对照组和运动组比较显著增加，hepcidin表达量显著降低。这表明长时间大强度运动抑制EPO表达，使红细胞生成量减少，机体运氧能力降低；补充山菠菜多糖后，大鼠肾脏EPO表达量增加，hepcidin表达受到抑制，机体铁水平升高，机体铁缺乏得以改善。

3.3 长时间大强度运动中大鼠机体hepcidin和铁状态的变化

Hepcidin作为维持机体铁稳态的核心分子，主要通过抑制小肠铁吸收、网状内皮系统铁释放和肝铁动员负调控机体铁稳态。Hepcidin与膜铁转运蛋白-1（ferroportin-1，FPN-1）相互作用，引起FPN-1内化和降解，降低细胞向外释放铁的能力，进而影响机体铁代谢。本研究结果显示，长时间大强度运动后大鼠机体hepcidin表达量与对照组比较显著升高，机体铁状态显著下降。Hepcidin水平升高诱发机体铁缺乏，低表达则会造成铁过载，引发遗传性血色素沉着等多种慢性疾病［28］。本研究结果表明，长时间大强度运动引起hepcidin高表达，高水平hepcidin会降低网状内皮细胞向血清中释放铁的能力，同时小肠铁吸收及机体铁转运受到抑制，导致机体铁水平下降，进而引起机体铁缺乏，影响机体铁代谢。补充多糖后，肝脏hepcidin合成量降低，FPN-1重新在小肠上皮细胞和网状内皮细胞表面表达，巨噬细胞向血清中释放铁的能力及小肠细胞的摄铁能力均得以增强，血清中铁含量增加，保证了机体铁的正常需求。

4 总结

补充山菠菜多糖能刺激长时间大强度运动大鼠肾脏EPO分泌，抑制大鼠肝脏SMAD4和hepcidin mRNA表达，改善长时间大强度运动大鼠机体铁缺乏症。但其中EPO通过何途径影响SMAD4表达仍需研究。

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