桃红四物汤对肝纤维化大鼠肝组织星状细胞增殖的影响

罗利琼，陈东波

(1.广东药学院生命科学与生物制药学院;2.广东药学院基础学院，广东 广州 510006)

肝纤维化不是一个独立的疾病，而是各种慢性肝病的共同病理学基础，许多慢性肝脏疾病均可引起，也是慢性肝病发展到肝硬化必经阶段。现代医学研究表明合理治疗可以逆转肝纤维化的进程，从而缓减甚至治愈肝纤维化［1］。肝星状细胞 (hepatic stellate cell，HSC)的激活和增生被认为是肝纤维化发生、进展的中心环节。通过促进HSC凋亡并抑制其增殖来发挥抗肝纤维化作用已成为目前研究的热点。中药及其复方具有多成分、多环节与多途径的作用特点，以其独特的疗效，在抗纤维化的研究中占有日益重要的地位［2，3］。中医研究证实，活血化瘀为治疗肝纤维化的基本治法，在此基础上注重病证结合，进行综合治疗，可有效抑制肝纤维化发展［4］。本文以桃红四物汤为研究对象，从影响HSC活化等方面进行研究，以期验证该方抗肝纤维化功效，深入探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar雄性大鼠40只，体重200±20g，由南方医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 药品制备 桃红四物汤由熟地、白芍、当归、桃仁、川芎、红花按4:3:3:3:2:2比例粉碎混合，按传统方法煎煮过滤，于恒温水浴锅中浓缩制成每毫升含生药1.0g。

1.1.3 试剂 分析纯CCl4购自苏州百与化工有限公司;HE、Masson染液由上海虹桥乐翔医用试剂有限公司提供;血清 GPT、GOT、ALB、TP、Bil试剂盒为上海申索佑福医学诊断用品有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 半自动生化分析仪 (康泰医学系统有限公司，型号:BC300);显微镜 (日本奥林巴斯公司，型号:ix71);流式细胞分析仪 (美国贝克曼库尔特公司，型号:FC500)。

1.2 方法

1.2.1 给药 取Wistar雄性大鼠分为4组，每组10只:对照组，模型组，桃红四物汤低、高剂量组。正常组除外，其它各组大鼠首次皮下注射纯CCl45mL/kg，以后皮下注射含20%CCl4的花生油3mL/kg，2次/周，连续12周。第7周起，低、高剂量桃红四物汤组灌胃相应剂量桃红四物汤水溶液，1次/天。

1.2.2 血清指标检测 末次给药并禁食16h，观察各组大鼠症状并称体重，以3%戊巴比妥麻醉大鼠后颈总动脉取血，离心 (3000r/min，15min)分离血清，放置于－20℃冰箱保存备用。严格按试剂盒说明书中操作方法检测肝功能生化指标GPT、GOT、ALB、TP 及 Bil。

1.2.3 病理学观察 迅速剖取各组大鼠肝脏相同部位组织，约0.5cm3，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色观察肝脏组织病理改变。

1.2.4 HSC增殖及凋亡检测 迅速剖取各组大鼠部分肝脏组织，生理盐水清洗，剪碎组织，经尼龙网 (200目)滤过制备细胞悬液，分选HSC，于柠檬酸缓冲液中放置1h，将细胞浓度调整至约1×106/ml，离心，去上清，加入A溶液 (胰酶消化液)1.8ml，充分作用后加入1.5ml B溶液 (胰酶抑制液)10min，加入1.5ml C溶液 (PI，碘化丙啶)作用15min;再次滤过尼龙网 (200目)，行流式细胞检测。

2 结果

2.1 大鼠一般状态 正常组大鼠动作灵敏，毛发光泽顺滑，食量及大便正常，体重明显增加。模型组大鼠现萎靡、嗜卧状，活动减少，毛色蓬松干枯，饮食减少，体态消瘦，体重明显减轻。桃红四物汤低、高剂量组大鼠上述表现较模型组有不同程度减轻。

2.2 血清指标 与正常组比较，模型组大鼠血清GPT、GOT、Bil水平明显升高 (P＜0.01)，TP、ALB水平明显降低 (P＜0.05)。与模型组比较，低、高剂量桃红四物汤组血清GPT、GOT、Bil水平明显降低 (P＜0.05或P＜0.01)，高剂量桃红四物汤组血清 TP、ALB水平明显升高 (P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清肝功能指标水平 (，n=10)

表1 各组大鼠血清肝功能指标水平 (，n=10)

注:与模型组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01。下表同。剂量 (g/kg/d)按生药计。

2.3 病理结果 HE染色显示，正常组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞索呈放射状整齐排列，肝窦正常，未见胶原纤维增生及炎性细胞浸润。肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构不清，肝细胞索排列紊乱，部分肝细胞肿胀，脂肪变性坏死，组织坏死、团块再生和炎性细胞浸润明显，汇管区可见大量纤维细胞、成纤维细胞和胶原纤维。与模型组比较，低、高剂量桃红四物汤组大鼠上述表现有不同程度改善。

2.4 HSC增殖及凋亡 与模型组比较，桃红四物汤组大鼠HSC凋亡率明显提高 (P＜0.05或P＜0.01)，HSC处于G0/G1期细胞比例明显增多 (P＜0.05或 P＜0.01)。见表2。。

表2 桃红四物汤对HSC凋亡率和细胞周期的影响 (，n=10)

表2 桃红四物汤对HSC凋亡率和细胞周期的影响 (，n=10)

3 讨论

肝脏遭到各种致病因子侵袭时，引起肝脏损害与炎症反应，激活肝组织免疫系统而进行组织修复。肝纤维化是指这种组织修复过程过度及失控时，肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。CCl4诱导大鼠肝损伤模型是研究肝损害和肝纤维化的经典方法。其机制为CCl4经肝细胞微粒体内细胞色素P450代谢裂解成的三氯甲基自由基而致脂质过氧化，并介导肝细胞损伤，如肝细胞脂肪病变及坏死，从而激活贮脂细胞，导致胶原分泌增加，形成肝纤维化［5］。

肝纤维化形成过程中，脂质过氧化使肝细胞膜受损，导致肝细胞内ALT、AST等酶外漏，血清ALT和AST活性增高［6］。血清总蛋白 (TP)、白蛋白 (ALB)为反映肝细胞合成代谢功能的指标，肝功能受损时，二者在血液中浓度随之降低，其降低程度与肝功能损害程度呈正相关。肝损伤后，因胆红素代谢和排泄障碍导致血清Bil水平增高。因此，血清ALT、AST、Bil、TP、ALB水平为反映肝功能受损程度的指标。

HSC位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的窦周间隙内，为肝脏的一种非实质细胞。正常情况下，HSC处于静止状态，具有储存维生素A和脂肪，合成和分泌蛋白多糖、胶原蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)及其组织抑制剂 (TIMP)的功能。肝损害 (病毒、化学物质、机械损伤等因素)时，在肝细胞坏死及炎症刺激下，肝脏内细胞因子 (包括HSC自分泌和旁分泌的细胞因子)通过各种传导通路激活HSC，使其大量增殖、迁移，并分泌大量的细胞外基质 (ECM)沉积于肝脏，活化的HSC使其增生转化为肌样成纤维细胞，从而启动并维持肝纤维化的发生发展。因此，抑制HSC的增殖或诱导活化的HSC凋亡都可显著减少ECM沉积从而减轻纤维化程度［7］。

本研究结果显示，桃红四物汤可使肝纤维化模型大鼠血清GPT、GOT、Bil水平明显降低，而血清TP、ALB水平明显升高;能有效增加HSC的凋亡，并使HSC处于G0/G1期细胞比例明显增多而降低HSC增殖率。提示桃红四物汤可改善肝纤维化大鼠基础生化指标，减轻病理程度，其作用机制可能与促进HSC凋亡并抑制HSC的增殖有关。

［1］谢晶日，那坤，李明，等.中医药治疗肝纤维化临床研究进展［J］.中国中医急症，2009，18(3):433－435

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［3］洪朝金.肝纤维化病机治法研究概况 ［J］.中华中医药学刊，2007，25(2):330－331

［4］刘燕玲，李志更，郭朋，等.以活血化瘀法为核心治疗肝纤维化的思路 ［J］.中医杂志，2009，50(1):76－79

［5］赵玉瑶，刘方洲，杨小平，等.臌胀片抗大鼠肝纤维化作用的实验研究 ［J］.中国中西医结合杂志，2003，23(12):922－925

［6］童英，闫向东，高珊，等.四氯化碳急性肝损伤敏感指标的研究［J］.中国食品卫生杂志，2000，12(6):10－13

［7］K Breitkop，f B Lahme，CG Tag，et al.Expression andmatrix deposition of latent transforming growth factor beta binding proteins in normal and fibrotic rat liver and transdifferentiating hepatic stellate cells in culture［J］.Hepatology，2001，33(3):387－396