TBA-Pb2+-hemin模拟酶催化显色法测定水中痕量铅

刘珊渡，杨雪蔚，周武雄，王永生

(南华大学公共卫生学院，湖南衡阳 421001)

铅是一种环境中普遍存在的重金属污染物，有蓄积毒性，能造成人体多器官、多系统的损害［1］。因此，环境中铅的检测尤为重要。目前，铅的检测方法主要有原子吸收法［2］、分光光度法［3］、电化学方法［4］等。但要实现快速、低成本、稳定、灵敏的检测，仍然是一个具有挑战性的课题。

近年来，适体由于其特异性和稳定性好而被广泛应用于生物传感领域。凝血酶适体(TBA)(序列为 5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3')［5］，能特异性地结合 Pb2+，形成 G-四聚体结构［6］。

本文基于该G-四聚体与氯化血红素(hemin)结合后，形成辣根过氧化物模拟酶［7］，可催化H2O2氧化 2，2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，生成蓝绿色自由基产物，导致体系在416 nm处的吸光度增加的原理，建立测定Pb2+的比色新方法，并应用于环境水样测定。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硝酸铅、Tris-HCl缓冲液等均为分析纯;TBA，色谱纯;实验用水为灭菌二次蒸馏水。

UV2550型紫外-可见分光光度计;AB204-S型电子分析天平;HH-W21-600型电热恒温水浴箱;PB-21精密酸度计。

1.2 实验方法

于1.5 mL EP 中，依次加入 0.1 mol/L pH 7.4的 Tris-HCl缓冲液 200 μL，1.0 × 10－6mol/L TBA溶液50 μL，1.0 ×10－7mol/L 铅标准溶液适量，室温反应40 min。加入2.0×10－5mol/L hemin溶液50 μL，放置 60 min。加入 5.0 × 10－3mol/L ABTS溶液 50 μL 和 1.2 ×10－2mol/L H2O2溶液 50 μL，用蒸馏水稀释至500 μL，避光放置10 min。在紫外-可见分光光度计上200～700 nm波长范围内进行扫描，得到吸收光谱。取最大吸收波长415 nm处的吸光度值A和试剂空白A0，得到△A=A－A0。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

由图1可知，TBA-hemin-ABTS-H2O2体系在415 nm处的吸光度值很低，加入Pb2+后，体系在415 nm的吸光度增强(图1A)。可能的理由是，Pb2+能够促进富G序列的凝血酶适体(TBA)生成G-四聚体结构，G-四聚体和氯化血红素复合物具有过氧化物模拟酶活性，能够催化H2O2氧化2，2'-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，生成蓝绿色自由基产物，导致体系在416 nm处的吸光度增加。随着体系Pb2+浓度的增加，体系的吸光度值相应增加，并在一定范围内与Pb2+浓度具有良好的线性关系(图1B)。据此，建立了DNA模拟酶催化显色法测定Pb2+的新方法。

图1 Pb2+测定体系吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of Pb2+systemA:cPb2+=2.0 ×10－9mol/L，cTBA=1.0 ×10－7mol/L;B:cPb2+:(1 ～7)/(×10－9mol/L)=0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0

2.2 实验条件的优化

2.2.1 缓冲体系的选择 实验了 Tris-HCl、Tris-CH3COOH和HEPES三种缓冲液对体系的影响。结果表明，体系在Tris-HCl缓冲溶液中△A最大，线性关系最好;进一步实验不同pH的影响，结果表明，pH 在6.8～7.4之间△A 逐渐增大，7.4 ～7.6 之间△A较大且稳定，7.6～8.0之间△A逐渐减小，因此，实验选择pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液。

2.2.2 TBA用量的选择 研究了TBA浓度对于体系的影响，结果表明，TBA 浓度在 0.2×10－7～1.0×10－7mol/L逐渐升高，当浓度 达到 1.0 ×10－7mol/L时趋于稳定。因此，体系TBA浓度选择1.0 ×10－7mol/L。

2.2.3 Hemin用量的选择 研究了hemin的用量对反应体系的影响，实验结果表明hemin用量在10～40 μL 范围内，ΔA 逐渐增大，40～60 μL 范围内趋于稳定，＞60 μL后，ΔA逐渐减小。所以实验选择2.0 ×10－5mol/L hemin 用量为50 μL。

2.2.4 c(ABTS):c(H2O2)的选择 结果显示，当c(ABTS)∶c(H2O2)为1∶2.4时，ΔA最大且基本恒定，而当ABTS的量过多或过少时，ΔA均减小。故实验选择 c(ABTS):c(H2O2)=1∶2.4。

2.2.5 反应温度及时间的影响 实验了20～100℃以及10～100 min内，反应体系吸光度的变化，结果表明，选择20～25℃下，反应40～60 min时，体系ΔA最大且基本稳定。

2.2.6 试剂加入顺序的影响 在以上优化的实验条件，设计不同试剂加入顺序，分别测定其吸光度变化值。实验发现，以Tris-HCl→TBA→Pb2+→ Hemin→ABTS→H2O2→H2O的加入顺序所得体系的△A最大。

2.2.7 标准曲线、检测限与精密度 按以上优化的实验条件，分别测定吸光度，绘制标准曲线，实验结果表明，线性范围为 1.07 ×10－10～6.01 ×10－7mol/L，线性回归方程为 ΔA=0.409c(×10－9mol/L)+40.7，相关系数 r=0.996 6;对 Pb2+为1.5 ×10－8，6.0 ×10－8，1.5 ×10－7mol/L 的 3 种标准溶液进行7次平行测定，相对标准偏差为0.67%，1.25%和 3.45%;经 11 次空白平行测定，按照 CL=3Sb/k公式计算，检出限为 3.21×10－11mol/L。

2.3 共存物质的影响

根据可能共存的实际情况，考察了多种干扰物质对测定结果的影响，结果表明，当相对误差控制在±5% 以内时:500 倍量的 Fe3+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Ni+、Co2+、Cr3+、Cd2+、Cl－、NO3－;10 倍量的 Na+、Hg+、K+均不干扰测定。

2.4 样品分析

采集了2份分别来自湘江不同水域的水样。按本实验方法对每份样品做6次平行测定，并进行加标回收实验，结果见表1。

表1 环境水样测定结果(n=6)Table 1 The determination results of Pb2+in environmental water samples

3 结论

在pH 7.5 Tris-HCl缓冲溶液中，以TBA为识别元件，ABTS为显色剂，建立了基于过氧化物模拟酶的铅离子比色检测新方法。方法线性范围为1.07×10－10～ 6.01 × 10－7mol/L，检出 限 为 3.21 ×10－11mol/L，方法灵敏度高、特异性好，结果满意。

［1］金海丽.铅毒性的研究进展［J］.广东微量元素科学，2004，11(10):9-14.

［2］Chen J，Teo K C.Determination of cadmium，copper，lead and zinc in water samples by flame atomic absorption spectrometry after cloud point extraction［J］.Analytica Chimica Acta，2001，450(1):215-222.

［3］Ahmed M J，Mamun M A.Spectrophotometric determination of lead in industrial，environmental，biological and soil samples using 2，5-dimercapto-1，3，4-thiadiazole［J］.Talanta，2001，55(1):43-54.

［4］Huang M R，Gu G L，Shi F Y，et al.Development of potentiometric lead ion sensors based on ionophores bearing oxygen/sulfur-containing functional groups［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2012，40(1):50-58.

［5］白金，燕淤摇，马福祥，等.水样中铅离子含量的测定［J］.大学化学，2013，28(1):37-39

［6］付晓蓓.共振瑞利散射测定孔雀石绿，铅和凝血酶的新方法研究［D］.重庆:西南大学，2012.

［7］李旺.金属纳米粒子与DNAzyme在电化学与比色传感中的研究与应用［D］.长沙:湖南大学，2011.