过表达CD82对植入期小鼠子宫内膜整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin表达的影响

尉晓蔚，谭冬梅，张倩，何通川，谭毅

(1.大连大学附属中山医院,大连 116001;2.重庆医科大学实验动物中心,重庆 400016; 3.美国芝加哥大学分子肿瘤实验室)

研究报告

过表达CD82对植入期小鼠子宫内膜整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin表达的影响

尉晓蔚1，谭冬梅2，张倩2，何通川3，谭毅2

(1.大连大学附属中山医院,大连 116001;2.重庆医科大学实验动物中心,重庆 400016; 3.美国芝加哥大学分子肿瘤实验室)

目的探讨CD82对着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞内整合素αV、β3、E-cadherin以及β-catenin蛋白表达的影响。方法将构建的CD82腺病毒转染原代培养的小鼠子宫内膜上皮细胞。检测妊娠小鼠子宫内膜上皮细胞转染CD82腺病毒后,细胞内整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin的表达变化情况。结果提取的上皮细胞纯度为(93.2±0.6)%。构建的CD82腺病毒转染效率达到 (92.0±4.5)%,转染原代培养的小鼠子宫内膜上皮细胞24 h后,RT-PCR检测发现CD82基因表达明显升高。转染48 h后,Western blot检测CD82蛋白水平明显升高。免疫细胞化学检测妊娠第4天的小鼠子宫内膜上皮细胞转染CD82腺病毒后,整合素αV、β3以及β-catenin的表达较未转染组均有明显上升(P＜0.05),但E-cadherin的表达量无明显变化(P＞0.05)。结论 胚胎植入前, CD82可能影响小鼠子宫内膜上皮细胞内整合素αV、β3和β-catenin的蛋白表达。

CD82基因;重组腺病毒;子宫内膜上皮细胞;原代培养;孕小鼠

【Key words】CD82 gene;Recombinant adenovirus;Uterine epithelial cells;Primary cell culture;Pregnantmice

胚胎着床是生殖的关键步骤,包括胚胎与子宫内膜的识别,黏附以及植入［1］。首先,胚胎定位并黏附到接受态的子宫内膜上皮细胞表面,随后胚胎穿透子宫内膜表面,植入子宫内膜基质中,完成植入。子宫内膜从非接受态转变为接受态时,不仅形态发生变化,其表面还表达许多黏附分子及黏附相关分子,有利于胚胎着床的进行［2］。

CD82糖蛋白属于四次跨膜糖蛋白,在肿瘤转移、免疫应答、创伤愈合、胚胎着床等过程中发挥重要作用［3］。CD82作为肿瘤转移抑制因子,在子宫内膜癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌以及宫颈癌等多种癌症中的表达明显降低甚至缺失,其机制可能是由于 CD82可以抑制肿瘤转移和迁移［4］。Gellersen等［5］发现胚胎滋养层细胞不表达CD82,但是母胎界面的蜕膜细胞大量表达CD82,提示CD82可能参与胚胎植入。我们的前期研究结果表明,CD82在小鼠动情周期、早孕及假孕的子宫内膜中均有规律表达［6,7］。胚胎植入的前提是胚胎与子宫内膜上皮细胞之间的相互黏附,然而CD82是否参与该黏附过程尚无报道。本实验室构建CD82腺病毒转染原代培养的小鼠子宫内膜上皮细胞。观察CD82蛋白高表达时,与黏附相关的整合素αV、β3、E-cadherin和β-catenin四个因子的蛋白表达变化情况,从而寻找CD82在胚胎植入可能参与的信号通路和相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

兔抗小鼠CD82抗体、小鼠抗小鼠角蛋白抗体、山羊抗小鼠波形蛋白抗体、兔抗小鼠integrinαV抗体、山羊抗小鼠integrinβ3抗体、兔抗小鼠E-cadherin抗体、山羊抗小鼠β-catenin抗体均购自美国Santa Cruz公司。生物素化兔二抗、山羊二抗、小鼠二抗、链霉素亲和素-过氧化物酶复合物以及DAB显色试剂盒等均购自中国北京中山生物技术有限公司。293细胞系购自美国ATCC细胞库。1640培养基购自美国Invitrogen公司。胎牛血清购自美国GIBCO生物公司。Trypsin购自美国Sigma公司。

1.1.2 实验动物

SPF级KM小鼠,6周龄,雌性,体重18～20 g,购自重庆医科大学实验动物中心［SCXK(渝)2007 -0001］。无菌手术在重庆医科大学实验动物中心屏障动物实验设施进行［SYXK(渝)2007-0001］。所有实验操作程序均经过重庆医科大学动物使用管理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养

将妊娠第4天的雌鼠分别处死后取子宫,去除子宫周围的结缔组织和脂肪。用PBS清洗子宫并将其纵向切开,内膜面朝上展平于培养皿中,加0.5%trypsin静置2 h(4℃)和0.5 h(37℃)。之后,将子宫组织移入15mL离心管内,反复吸打后弃去子宫组织,溶液经1000 r/min离心10 min后弃去上清液;底层的细胞悬液再加入含10%血清的培养基反复清洗2次后,以1×106/mL浓度接种到6孔板内,37℃,5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 重组CD82腺病毒的扩增和提取

本实验室已经成功构建含小鼠CD82全基因的重组腺病毒［8］。当293细胞至80%融合时,转染腺病毒原液。每0.4μL病毒原液(6.5×1012pfu/mL)转染5×105细胞。在37℃,5%CO2孵箱中培养,约48 h后荧光显微镜下观察RFP表达情况,此时约90%的293细胞出现红色荧光,且部分细胞漂起。将293细胞轻轻吹打下来,1000 r/min,离心5 min弃上清液,用150μL PBS重悬,收集细胞并反复冻融提取病毒液。将所提取的病毒液再转染293细胞,以大量制备病毒液。

1.2.3 重组CD82腺病毒的病毒滴度测定

将多次转染制备的病毒液做不同比例稀释(1∶104～1∶1012),将400μL稀释液加至293细胞培养板(24孔板)中,37℃,5%CO2孵箱中培养l8～24 h于荧光显微镜下计数RFP阳性细胞数。选择能转染的最高稀释倍数孔内细胞(有荧光)。按下列公式计算病毒滴度:病毒滴度=RFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数(pfu/mL)/0.4 mL。

1.2.4 CD82腺病毒转染上皮细胞

妊娠4d的小鼠子宫内膜上皮细胞,接种于10%多聚赖氨酸包被的小玻片上,24 h后转染扩增的CD82腺病毒。转染48 h后,荧光显微镜下观察红色荧光。计算转染效率。

1.2.5 RT-PCR

转染24 h后,Trizol试剂制备总RNA,具体操作按试剂操作说明书进行。经A260/A280的比值和电泳检测结果检测RNA的纯度,并计算RNA含量(RNAμg/mL=A 260×40×稀释倍数),所得样品置于-80℃保存。两步法反转录成cDNA。CD82上游引物为上游引物:5’-CAT AGA TCT ACC ATG GGG GCA GGC TGT GT-3’。下游引物为5’-TCA GTC GAC TCA GTA CTT GGG GAC CTT GC-3’。PCR反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s, 55℃退火30 s,72℃延伸30 s,扩增28个循环,72℃延伸10 min。

1.2.6 Western blot

转染48 h后,在冰上刮取贴壁生长的上皮细胞,加入细胞裂解液,提取细胞全蛋白。取50μg细胞全蛋白,进行12%SDS-PAGE电泳,之后转PVDF膜,一抗浓度1∶500,二抗浓度1∶1500。HRP-ECL化学发光法检测CD82蛋白水平。

1.2.7 免疫细胞化学

将原代提取到的上皮细胞,爬片于10%多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片上。妊娠第4天的上皮细胞,待其单层形成后取出玻片;转染腺病毒的妊娠第4天的上皮细胞,取80μL CD82腺病毒,转染48 h后取出玻片。各组均按免疫细胞化学常规步骤进行操作。各种多克隆抗体按1∶200稀释,以PBS代替一抗作为阴性对照。试剂公司提供的阳性对照照片作为阳性对照。

1.3 统计学处理

每个实验重复3次,结果均以均数±标准差表示。免疫组织化学使用Image-Pro Plus 6.0经软件进行分析。Lab works 4.60软件进行分析处理,以内参基因GAPDH为基准分析各条带的相对密度值。免疫细胞化学随机选择5个高倍视野观察细胞有无棕黄染色,根据染色强度及范围分别计分。累计0～1分为阴性(-),1～2分为弱阳性(+),2～3分为阳性(++),3～4分为强阳性(+++)。结果是每张片子随机选择的5个高倍视野的平均值。组间差异使用SPASS 13.0软件中的单因素方差分析以及t检验。以P＜0.05为差异有显著性,P＜0.01为差异有极显著性。

2 结果

2.1 小鼠子宫内膜上皮细胞的纯度鉴定

原代培养的小鼠子宫内膜上皮细胞排列紧密,分界不清,细胞核大而圆,位于细胞中央。靠近集落中央的上皮细胞较小,呈不规则形或多边形;位于集落外周的细胞,胞体较大,呈立方形或短柱状,有些细胞还围成腺体形态。采用上皮细胞特异的角蛋白抗体以及基质细胞特异的波形蛋白抗体对细胞进行免疫化学染色。角蛋白的阳性染色为棕色,主要分布在胞质区域(图1A);阴性对照组的细胞质区域均无阳性反应(图1 B)。波形蛋白抗体组的细胞质区域均无阳性反应(图1 C);显微镜下随机选择不同的区域,计数不同区域内免疫染色阳性的细胞数和细胞总数,然后计算其比值。统计结果显示,提取的上皮细胞纯度为(93.2±0.6)%。(图1见彩插11)。

2.2 重组CD82腺病毒的病毒滴度测定

以不同稀释度的重组腺病毒转染293细胞。在荧光显微镜下观察RFP的表达(图2),见1∶105和1∶106稀释孔内有较多细胞内有荧光,1∶104稀释孔内几乎全部细胞内有荧光。而1∶107至1∶109RFP表达的细胞逐渐减少。测得腺病毒转染滴度为2.2 ×108pfu/mL。

2.3 子宫内膜上皮细胞CD82基因和蛋白的表达

重组腺病毒转染小鼠子宫内膜上皮细胞48 h后,免疫荧光检测发现转染效率达到(92.0± 4.5)%(图2,彩插11)。RT-PCR和Western blot检测CD82基因和蛋白的表达水平。结果发现,重组CD82腺病毒组较对照组有明显的升高(图3)。

2.4 免疫细胞化学结果

免疫细胞化学结果显示,CD82蛋白表达于妊娠第4天的小鼠子宫内膜上皮细胞膜和细胞质。转染CD82腺病毒后,上皮细胞强阳性表达CD82蛋白,部分细胞的CD82蛋白甚至异位表达于细胞核内;整合素αV、β3和E-cadherin表达于妊娠第4天的小鼠子宫内膜上皮细胞细胞膜和细胞质;β-catenin蛋白表达于上皮细胞的细胞质;与空腺病毒组比较,转染CD82腺病毒的上皮细胞,整合素αV、β3和βcatenin表达明显上升(P＜0.05),E-cadherin的表达量无明显变化(P＞0.05)。各蛋白在小鼠子宫内膜上皮细胞的表达见图4(彩插12)。

3 讨论

CD82广泛表达于各个组织中［9］。CD82的表达变化与不同的生理和病理过程相关。例如,CD82表达水平的下降与子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌以及卵巢癌等多种肿瘤的恶性转移程度呈正相关［10］。CD82的增加与增强细胞黏附密切相关［11］。本实验室前期研究结果表明CD82在小鼠动情周期、早孕及假孕子宫内膜中均有规律表达［6,7］。另外,CD82与DARC的相互作用抑制血管内皮细胞的转移［12］,暗示我们CD82可能在母胎界面发挥黏附分子的作用。已有报道发现,CD82与其他TM4SF蛋白,或与整合素、E-cadherin结合,在细胞表面形成复合物,介导同型或异型细胞间的粘附,从而抑制肿瘤细胞的运动和侵袭能力［13,14］。

注:A:转染CD82腺病毒24 h后,RT-PCR检测CD82基因的表达;B:转染CD82腺病毒48 h后,Western blot检测CD82蛋白的表达。P组:妊娠第4天的小鼠子宫内膜上皮细胞;P +Ad组:转染空腺病毒组;P+Ad-CD82组:转染CD82腺病毒组。图3 CD82转染小鼠子宫内膜上皮细胞后CD82基因和蛋白的表达Note:A:RT-PCR analysis of expression of CD82mRNA at24 h after CD82 adenovirus transfection;B:Western blot detection of CD82 protein at48 h after CD82 adenovirus transfection.Pregnant group:primary cultured uterine epithelial cells on day 4;P +Ad group:transfection with control adenovirus;P+Ad-CD82 group:transfection with CD82 adenovirus.Fig．3 Expression of CD82 in the mouse uterine epithelial cells after CD82 adenovirus transfection.

处于接受态的子宫内膜,其上皮细胞形态发生了一系列有利于胚胎植入的超微结构的变化［15］。此外,在着床窗口期的子宫内膜上,许多分子表达水平的变化与其接受态的建立相关。黏附相关分子,例如粘蛋白和整合素,在着床窗口期的表达明显升高,参与子宫内膜接受态的建立［16,17］。αVβ3在子宫内膜上皮周期特征性表达,窗口期整合素αVβ3等表达水平的增高,与内膜“着床窗”开放的时间相吻合,可作为子宫内膜容受性的标志［18,19］。Ruseva等［20］研究发现过表达CD82可以显著增加整合素αVβ3/玻璃粘连蛋白-依赖的卵巢癌细胞的黏附。我们的结果发现CD82高表达可以明显增加整合素αV和β3的蛋白表达,提示我们CD82可能是整合素αV和β3的上游调控因子。

E-cadherin介导细胞间相互聚集。E-cadherin与β-catenin形成复合物后,在细胞内与细胞骨架的微丝系统相连。如果不能形成E-cad/β-cat复合物,将导致上皮细胞之间的粘附力的下降或丧失。我们前期研究发现,CD82在胚胎卵裂时可能与E-钙黏素等细胞粘附分子结合,促进了胚胎的致密化,从而促进胚胎发育至囊胚［21］。本实验免疫细胞化学显示,转染CD82腺病毒组和空腺病毒组,其E-cadherin表达没有统计学差异,说明CD82不能改变细胞水平的E-cadherin,也不能改变E-cadherin的定位。但是转染CD82腺病毒后,β-catenin蛋白出现明显的上调。推测CD82可能通过调节β-catenin的表达在E-cad/β-cat复合物中发挥作用。

总之,我们认为胚胎植入前,小鼠子宫内膜上皮细胞内整合素αV、β3和β-catenin的表达可能受CD82的影响,为进一步研究CD82基因在胚胎着床中的作用奠定了基础。

(本文图1，2见彩插11，图4见彩插12。)

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Effect of CD82 on the expression of integrinαV,β3,E-cadherin and β-catenin in uterine epithelial cells in pregnantm ice

WEIXiao-Wei1,TAN Dong-Mei2,ZHANG Qian2,HE Tong-Chuan3,TAN Yi2*
(1.Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian 116001,China; 2.Chongqing Medical University,Chongqing 400016;3.Molecular Tumor Laboratory,Chicago University)

ObjectiveUterine epithelial cellswere isolated from pregnantmice and cultured in vitro,and examined the effect of CD82 on the expression of integrinαV,β3,E-cadherin andβ-catenin in the cells.M ethodsThe uterine epithelial cellswere primarily isolated from pregnantmouse uterus.The recombinantadenovirus containingmouse CD82 gene which had been constructed in our lab infected the uterine epithelial cells.Immunocytochemistry was used to detect the protein expressions of integrinαV,β3,E-cadherin andβ-catenin in the uterine epithelial cells,which were infected with CD82 adenovirus or not.Results1.The purity of primary cultured cellswas(93.2±0.6)%.2.The transfection efficiency of CD82 recombinant adenovirus was(92±4.5)%.The adenoviral particles carrying CD82 gene indeed expressed CD82 gene and protein in the primary uterine epithelial cells after 24 hours or 48 hours.3.The uterine epithelial cells of pregnantmice on d4 expressed integrinαV,β3,E-cadherin andβ-catenin.4.In contrast to the control group, when CD82 adenovirus infected cells,the uterine epithelial cells of pregnantmice on d4 increased the expression of integrin αV,β3 andβ-catenin protein,had no significant changes of E-cadherin.ConclusionsCD82 may have effect on the expression of integrinαV,β3 andβ-catenin inmouse uterine epithelial cells before implantation.

Q95-33,Q492

A

1005-4847(2014)03-0057-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.012

2014-01-20

国家自然科学基金(30470654);重庆市自然科学基金(2009BB5409);教育部博士点科研基金(20095503110006)。

尉晓蔚(1983年-),女,助理研究员。研究方向:胚胎着床的分子机制。E-mail:angelwei2003@163.com

谭毅(1966年-),男,教授,研究员。研究方向:胚胎着床和实验动物学。E-mail: tanyee66@hotmail.com