响应面法优化芝麻饼粕蛋白的制备条件1

王振斌，王玺，林晓明，马海乐，王林，马晓珂，王干，白志杰

( 江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

芝麻属胡麻科（Pedecliecease）胡麻属（Sesamum indicum L.）植物，又名胡麻、白麻、油麻、脂麻，是世界上最古老的油料作物之一，产量在世界油料作物中占第七位[1-4]。芝麻饼粕是芝麻籽实取油后的副产物。在我国 80%以上的芝麻用来榨取芝麻油，年产量就在 50万 t以上。芝麻饼粕蛋白质平均含量在40%～46%，粗脂肪含量在3.4%～10.3%，粗纤维含量在2.6%～5.6%，还含有少量的钙、磷等矿物质[4]。芝麻饼粕蛋白质氨基酸种类齐全，并且含量丰富，特别是含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸），显著高于其他植物，且无抗营养因子[5]，除赖氨酸含量略低外，其他接近或达到FAO/WHO的推荐值，是一种很好的蛋白质资源[6-7]。

分离制备植物蛋白质的方法多种多样，例如碱溶酸沉法、酶解法、反胶束法、膜分离法等[8-18]。碱溶酸沉法是目前应用的最多而且已用于产业化的方法，该法操作简便、易于控制、成本低廉。芝麻蛋白质主要是碱溶性蛋白质，约占67%，在碱性条件下溶解度较大，一般仍采用碱溶酸沉法从芝麻饼粕制取芝麻分离蛋白质[7-8]。目前研究大多以测定溶解在碱液中的氮的总量计算提取率，而蛋白质在碱液中降解为肽或氨基酸的部分难以酸沉得到，导致蛋白提取率难以准确判断。以水代法制备芝麻油的饼粕制备蛋白的研究较少。

本文以芝麻饼粕为原料，采用碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质，并通过单因素试验及响应曲面设计优化出碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质的最佳工艺参数，为芝麻饼粕蛋白质进一步制备功能肽等的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芝麻饼粕 新沂吉顺昌油脂科技有限公司，其中粗蛋白质35.99%，粗脂肪15.28%，水分8.48%，灰分9.96%，其他35.61%。

无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、硼酸、硫酸、硫酸铜、硫酸钾等（分析纯） 购于国药集团化学试剂公司。

Fz-4药物粉碎机 温岭市百乐粉碎设备厂；pH5-3C型pH计 上海理达仪器厂；HH-A恒温水浴搅拌锅 江苏金坛市中大仪器厂；SPF401F电子天平 奥豪斯国际贸易（上海）中国有限公司；TGL-16高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康试验仪器有限公司；FOSS 2100型凯氏定氮装置 上海新嘉电子有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质的工艺 取过 80目筛的芝麻饼粕若干克，加入90mL的去离子水配成相应浓度的溶液，以1mol/L NaOH溶液调pH，在一定温度下用磁力搅拌器搅拌一定时间。离心过滤，所得上清液即为芝麻饼粕蛋白质提取液。以1mol/L 盐酸调上清液pH至4.0（芝麻饼粕蛋白质等电点）使蛋白质沉淀，静止30min后4500r/min离心20min，弃上清，所得沉淀再加5倍体积70%乙醇，室温浸泡30min，离心，再加两次2倍体积去离子水洗涤，离心，下层蛋白质真空冷冻干燥即得芝麻饼粕蛋白质产品。测定其蛋白质含量，并计算蛋白质提取率。

1.2.2 蛋白质提取率和蛋白质得率的计算 采用半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，用式（1）和式（2）计算芝麻饼粕蛋白质提取率和得率：

1.2.3 碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质的单因素设计 在碱液提取芝麻饼粕蛋白质的过程中，分别研究NaOH浓度（0、0.11、0.22、0.33、0.44、0.55mol/L），液料比（5、10、15、20、25、30、35mL/g），提取温度（30、40、50、60、70、80、90℃），提取时间（0.5、1、2、3、4、5、6h）及提取次数（1、2、3、4次）对蛋白质提取率的影响。

1.2.4 碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质的响应面优化设计 根据Box-Behnken[19-20]中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取NaOH浓度、提取温度、提取时间、液料比为响应面分析试验的因素，进行4因素3水平设计（表1）。通过Design Expert 7.0 Trial软件对试验结果进行回归分析，预测最优参数。

表1 响应面分析因素与水平表Tab.1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 芝麻饼粕蛋白质等电点的测定 将提取的芝麻饼粕蛋白质溶液，分装到 5只离心管中，每只100mL，用HCl调至不同的pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0），静止30min后4500r/min离心20min，测定上清液中的蛋白质含量，并计算蛋白质的沉淀量。

1.2.6 数据处理方法 采用 SPSS软件分析，所得试验结果用“平均值±标准误差”表示。p<0.05 为差异显著水平，p<0.01 为差异极显著水平。

2 结果与分析

2.1 碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质的单因素试验

2.1.1 NaOH浓度对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响 在液料比为15，提取温度为60℃，提取时间为4h，提取次数1次的条件下，NaOH浓度对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响如图1（A）所示。由图1（A）可知，在NaOH浓度0～0.33 mol/L范围内，芝麻饼粕蛋白质提取率随 NaOH浓度的增大而提高，各组间差异显著（p<0.05）。当NaOH浓度为0.33 mol/L时蛋白质提取率达到57.36%，此后随着NaOH浓度的继续升高蛋白质提取率未见显著变化。芝麻蛋白质中，80%为α球蛋白质，由于经过压榨处理而变性，其水溶性降低，但仍可在碱性条件下适度降解而溶出。稀碱有利于蛋白质的提取，过高碱液浓度时，蛋白质提取率有所下降，并且过高碱液浓度会改变蛋白质的营养学特性，生成赖氨酰丙氨酸这些物质有毒，引起营养物质的损失[21]。高碱还会使蛋白质变性和水解，不利于被酸沉淀，影响蛋白质提取率，同时，也增强了美拉德反应，影响产品色泽[22]。综合考虑，选择NaOH浓度0.33 mol/L作进一步优化。

2.1.2 液料比对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响 在提取液 NaOH浓度为 0.33 mol/L，提取温度为60℃，提取时间为4 h，提取次数1次的条件下，液料比对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响如图1（B）所示。由图1（B）可知，随着液料比的增大，芝麻饼粕蛋白质提取率不断增大，当液料比为25时芝麻饼粕蛋白质提取率为 66.09%，此后随着液料比继续增大，蛋白质提取率增加缓慢。如果液料比过小，提取体系的黏度过大，物料扩散速度慢，不利于蛋白质的溶出，使提取不完全。增大液料比，蛋白质提取率增加，但增加的幅度不大，且过大的料液比不利于蛋白质提取后的浓缩沉淀。因此考虑到成本及后面的离心沉淀步骤，选取液料比25作进一步优化。

2.1.3 提取温度对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响 在提取液 NaOH浓度为 0.33 mol/L，液料比为25，提取时间为4 h，提取次数1次的条件下，提取温度对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响如图1（C）所示。由图1（C）可知，在温度30～60℃范围内，芝麻饼粕蛋白质提取率随温度的升高而提高，各组间差异显著（p<0.05）；当温度达到70℃时蛋白质提取率为74.05%，此后再提高温度，蛋白质提取率增加缓慢。这是因为较高的温度增加了蛋白质的溶解度和溶出速率。考虑到过高的温度可能对蛋白质结构和活性造成影响，并且温度高，能耗大，因此选取提取温度70℃作进一步优化。

2.1.4 提取时间对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响 在提取液 NaOH浓度为 0.33 mol/L，液料比为25，提取温度为70℃，提取次数1次的条件下，提取时间对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响如图 1（D）所示。由图 1（D）可知，在提取时间0～4 h范围内，芝麻饼粕蛋白质的提取率随着提取时间的延长而增大，超过4 h后芝麻饼粕蛋白质提取率稍有下降。这可能是由于在加热作用下分子震动加快，摩擦增加蛋白质的溶解作用，从而有利于提取。但是提取时间过长可能导致蛋白质变性。考虑到能源和蛋白质在高温下品质保持的问题，故选择提取时间4 h作进一步优化。

2.1.5 提取次数对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响 在提取液 NaOH浓度为 0.33 mol/L，液料比为25，提取温度为70℃，提取时间为4h的条件下，提取次数对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响如图1（E）所示。由图1（E）可知，提取次数对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响不显著（p>0.05)。多次提取试验不仅耗能耗时，而且对蛋白质提取的影响很小，因此选取提取次数1次作进一步蛋白质优化的研究。

1 各因素对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响注：A ：NaOH浓度、B：液料比、C：提取温度、D：提取时间和E：提取次数Fig.1 Effects of the extraction conditions on the extraction rate of sesame cake protein

2.3 响应面法优化碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质的提取工艺

根据单因素试验结果，选取对芝麻饼粕蛋白质提取率影响显著的4个因素（NaOH浓度、提取温度、提取时间、液料比），利用Design-Expert 7.0 Trial软件设计了4因素3水平的响应面分析试验，试验设计与结果见表2，方差分析见表3。

表2 Box-Behnken 试验设计及结果Tab. 2 Design and result of Box-Behnken experiment

23 0 -1 0 1 68.56 24 0 1 0 1 75.13 25 0 0 0 0 74.9 26 0 0 0 0 73.28 27 0 0 0 0 72.97

表3 方差分析Tab. 3 Analysis of variance

各因素经二次多项回归拟合后，得到芝麻饼粕蛋白质提取率（Y）与 NaOH浓度、提取温度、液料比、提取时间四个因素的二次多项回归方程如式（3）所示：

从表 4可以看出，该模型回归极显著，失拟项不显著，并且该模型的R2=0.9480，R2Adj=0.8874，说明回归方程的拟合度较好，可以较好解释模型的变化。其中模型一次项X1、X2、X3、X4，交互项X1X4、二次项X12对试验结果的影响是极显著的，X22达到显著水平，其余项均不显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，NaOH浓度>提取温度>液料比>提取时间。

剔除不显著项，简化后的二次多项回归方程如式（4）所示：

根据回归方程得到因子间的响应面分析图，如图2所示。图2反映了提取时间、NaOH浓度、液料比和提取温度各因素两两之间的交互作用对芝麻饼粕蛋白质提取率的影响。

图2 交互作用对芝麻饼粕蛋白质提取率影响的响应图Fig.2 Response surface of effects on extraction rate of sesame cake protein

通过响应面回归方程，经 Design-expert软件分析，可以得出模型中最佳条件参数：NaOH浓度0.37 mol/L，提取温度75.19℃，提取时间4.7 h，液料比25.19，提取次数1次，在此参数下芝麻饼粕蛋白质提取率为76.22%。按上述最佳条件进行验证试验，重复三次芝麻饼粕蛋白质提取率分别为77.15%、76.84%、76.56%，其平均值为76.85%，与模型理论预测值76.22%无显著差异，表明该响应面模型是可行的。

2.3.4 芝麻饼粕蛋白质等电点的确定 选用pH 3.0～5.0对提取的芝麻饼粕蛋白质溶液进行沉淀，其沉淀率如图3所示。由图3可知，芝麻饼粕蛋白质的沉淀率在pH 4时最高。因此，芝麻饼粕蛋白质的最佳等电点为pH 4。

图3 不同pH对芝麻饼粕蛋白质沉淀率的影响Fig 3 Effects of different pH on protein precipitation rate

2.3.5 碱溶酸沉法制备的芝麻饼粕蛋白质基本成分的测定 利用等电点沉淀法（pH为4.0）获得的蛋白质经70%乙醇脱色处理后，产品颜色明显变浅，呈浅灰色，芝麻饼粕蛋白质得率为 38.11%。芝麻饼粕蛋白质产品成分为粗蛋白质58.76%，粗脂肪4.63，水分2.03%，灰分4.96，其他29.62。

3 结论

3.1 以脱脂后的芝麻饼粕为原料，采用碱溶酸沉法制备芝麻饼粕蛋白质。在单因素试验的基础上，通过响应面优化试验确定最佳工艺条件为：NaOH浓度 0.37 mol/L，提取温度75.19℃，提取时间4.7 h，液料比25.19，在此参数下芝麻饼粕蛋白质提取率为76.22%。

3.2 通过试验确定芝麻饼粕蛋白质等电点为pH 4，经沉淀、70%乙醇脱色、冷冻干燥后所得的芝麻饼粕蛋白质产品蛋白质含量为58.76%。

[1]Cano-Medina A, Jimé nez-Islas H, Dendooven L, et al. Emulsifying and foaming capacity and emulsion and foam stability of sesame protein concentrates[J]. Food Research International, 2011, 44(3): 684-692.

[2]董英, 邵元龙, 杨杰. 芝麻饼粕蛋白质提取与制备条件研究[J]. 粮油深加工, 2008,8: 106-110.

[3]洪瑶, 陈文伟, 朱悦, 等. 芝麻粕蛋白质的提取研究[J]. 中国食品添加剂, 2010, 4:169-173.

[4]王长生. 浅谈芝麻饼粕资源及饲料营养价值[J]. 饲料工业, 1995, 16(4): 35-36.

[5]Tunde-Akintunde T Y, Akintunde B O. Some physical properties of sesame seed [J].Biosystems Engineering, 2004, 88(1): 127-129.

[6]陈学红, 秦卫东, 马利华, 等. 芝麻渣蛋白的功能性研究[J]. 食品科学, 2008, 29(8):114-117.

[7]郑华丽, 魏安池, 牛新培. 芝麻饼粕蛋白质应用进展. 粮食与油脂, 2012, 8: 8-10.

[8]李凤霞, 张钟, 刘洪泉. 麻渣蛋白质的制备及其功能性质的研究[J]. 包装与食品机械, 2007, 25(2): 38-43.

[9]Escamilla-Silva E M, Guzmá n-Maldonado S H, Cano-Medinal A., et al. Simplified process for the production of sesame protein concentrate. Differential scanning calorimetry and nutritional, physicochemical and functional properties [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2003, 83(9): 972-979.

[10]Taha F S, Fahmy M, Sadek M A. Low-phytate protein concentrate and isolate from sesame seed [J]. Journal of agricultural and food chemistry, 1987, 35(3): 289-292.

[11]金鹏, 赵清. 黑芝麻蛋白质的分离、纯化[J]. 食品研究与开发, 2009, 30（8）:41-43.

[12]Achouri A, Nail V, Boye J I. Sesame protein isolate: Fractionation, secondary structure and functional properties [J]. Food Research International, 2012, 46(1): 360-369.

[13]张涛, 魏安池, 刘若瑜. 醇法芝麻浓缩蛋白质的制备工艺研究[J]. 中国油脂, 2011,36(12): 43-46.

[14]刘玉兰, 钟雪玲, 贾婷婷. 冷榨芝麻饼生产醇洗芝麻浓缩蛋白工艺条件的研究[J].农业机械, 2011 (20): 68-71.

[15]谭春兰, 袁永俊. 水酶法在植物油脂提取中的应用 [J]. 食品研究与开发, 2006,27(7): 128-130.

[16]Latif S, Anwar F. Aqueous enzymatic sesame oil and protein extraction[J]. Food Chemistry, 2011, 125(2): 679-684.

[17]黄纪念, 孙强, 李梦琴, 等. 芝麻蛋白的超声提取工艺研究[J]. 粮油加工, 2009 (8):69-71.

[18]陈学红, 秦卫东, 马利华, 等. AOT/异辛烷反胶束体系在萃取芝麻渣蛋白质中的应用[J]. 安徽农业科技, 2010, 38(14): 7534-7536.

[19]Karacabey E, Mazza G. Optimisation of antioxidant activity of grape cane extracts using response surface methodology [J]. Food chemistry, 2010, 119(1): 343-348.

[20]Mune Mune M A, Minka S R, Mbome I L. Response surface methodology for optimisation of protein concentrate preparation from cowpea [Vigna unguiculata (L.)Walp][J]. Food Chemistry, 2008, 110(3): 735-741.

[21]Hourigan J A, Chesterman C F. Application of carbohydrases in extracting protein from rice bran[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1997, 74(2): 141-146.

[22]朱晏鹏, 谢玉国, 田将, 等. 超声波辅助碱液提取芝麻饼粕蛋白工艺的研究[J]. 粮油加工, 2005, 6: 83-85.