急性心肌梗死后小鼠骨髓c-kit+干细胞的动员及意义

张晓江，何 敏，刘建芳，万 龙，杨 萍

(1吉林大学中日联谊医院，长春130033;2上海交通大学仁济医院)

急性心肌梗死后，梗死区域的心肌细胞失去功能，心脏的泵血功能受损可发生心力衰竭。研究发现，c-kit+干细胞可以改善心脏功能，但心脏中的ckit+细胞数量较少，不能完全阻止心力衰竭的发生。而骨髓单个核细胞(BM-MNCs)来源的c-kit+细胞经心肌注射或血管内注射可修复梗死的心肌。2013年6～10月，我们观察了急性心肌梗死小鼠BMMNCs中c-kit+干细胞的比例变化及细胞增殖核抗原(ki67)表达水平，探讨急性心肌梗死后小鼠骨髓c-kit+干细胞的动员及意义。

1 材料与方法

1.1 材料 8周的野生型纯合子C57BL/6小鼠10只，体质量22～25 g。TTC;Hanks平衡盐溶液(HBSS);牛血清白蛋白(BSA);胎牛血清(FBS);磷酸盐缓冲液(PBS);0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA);IMDM细胞培养基;4%多聚甲醛;Ficoll淋巴细胞分离液;RNA提取试剂盒;反转录及聚合酶链式反应试剂盒;琼脂糖粉末Agrose;TAE电泳缓冲液;核酸染料GelGreen;驴血清原液;兔抗鼠c-kit抗体，鼠抗鼠细胞增殖核抗原(ki67)抗体，驴抗兔Alex488，驴抗鼠Cy3;DAPI细胞核染料;小鼠c-kit磁珠。

1.2 实验方法

1.2.1 心肌梗死模型制备 将10只小鼠分为心梗组(8只)、对照组(2只)。于麻醉状态下在左侧第3、4肋间隙挤出心脏，心梗组结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型。对照组不结扎冠状动脉，其余操作与手术组相同。TTC染色后镜下观察，心肌组织出现白色提示梗死组织，即心肌梗死模型建立成功。

1.2.2 BM-MNCs分离、培养及相关指标检测

1.2.2.1 BM-MNCs分离、培养 模型制备后第 3、7天，心梗组采用扭断颈部各处死小鼠4只;对照组术后第7天处死。各组小鼠处死后，用剪刀和镊子小心剥离肌肉，分离小鼠的股骨和胫腓骨，浸泡于HBSS中;用剪刀剪断骨的两端，暴露骨髓腔;然后用5 mL注射器吸取2%FBS/PBS溶液，换取1 mL注射器的针头，插入骨髓腔，对准无菌15 mL离心管，将骨髓细胞冲入带有细胞过滤网的离心管中(每根骨用2.5 mL缓冲液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞)。取冲洗出的骨髓液，加入Ficoll淋巴细胞，常温下离心20 min，吸取中间云雾层于另一个15 mL离心管中;用PBS洗涤细胞，4℃离心5 min 2次，分离出BM-MNCs。配置10%FBS/IMDM培养基，将分离的BM-MNCs接种于96孔板，放置于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养48 h。

1.2.2.2 BM-MNCs指标检测 ①c-kit mRNA 表达:采用RT-PCR法。将用淋巴细胞分离液分离的BM-MNCs，按照试剂盒提供的操作流程进行操作，检测心梗组第3、7天及对照组第7天的c-kit表达。②c-kit+细胞比例:采用流式细胞术。将心梗组第3、7天及对照组的BM-MNCs用染色缓冲液及封闭液重悬细胞，4℃离心5 min;用封闭液重悬细胞并分管，每管中加入相应抗体1 μL，4℃或置冰上孵育30 min;加入冷PBS 1 mL，4℃离心洗涤1次;弃上清用适量PBS重悬后，冰上避光，BD Accuri C6流式细胞仪检测，并用C-Flow Plus1.0检测并分析BMMNCs中c-kit+细胞的比例。③c-kit+细胞分选:采用磁珠分选术。将心梗组第3、7天及对照组的BMMNCs用染色缓冲液及封闭液重悬细胞，4℃ 离心5 min;加入染色缓冲液80 μL中将细胞充分混匀;加入20 μL抗小鼠c-kit磁珠，于细细胞悬液后，吹打混匀，4℃ 旋转孵育15 min;添加染色缓冲液400 μL，将细胞悬液装入平衡后的分离柱上过柱。用0.5 mL的染色缓冲液重复2次;收集1.5 mL的c-kit－细胞悬液。将分离柱与磁铁分开后，添加染色缓冲液收集c-kit+细胞;收集到的c-kit+阳性细胞和c-kit－阴性细胞行细胞培养和后续检测。④ckit+细胞阳性率:采用细胞免疫荧光染色法检测对照组、心梗组第3、7天的BM-MNCs中c-kit+细胞的c-kit蛋白。将用4%多聚甲醛固定好的细胞，加0.4%Triton-X100破膜5～10 min，用血清封闭室温30 min～1 h;对应一抗用0.5%BSA/PBS稀释抗体，4℃孵育过夜;孵育后，二抗用0.5%BSA/PBS稀释抗体，用DAPI复染细胞核，Nikon Eclipse Ti-S荧光倒置显微镜下观察c-kit+细胞的c-kit阳性表达，用NIS-Elements软件分析染色阳性细胞的情况，统计c-kit+细胞阳性率。⑤c-kit+细胞、c-kit－细胞增殖情况:采用细胞免疫荧光染色法，取心梗后组制模第3天的c-kit+细胞、c-kit－细胞，观察并比较两者的ki67表达情况。

2 结果

2.1 c-kit mRNA水平 心梗组 BM-MNCs中c-kit mRNA表达水平高于对照组;心梗后第3天和第7天时骨髓单个核细胞中c-kit mRNA水平升高，且第3天高于第7天。见图1。

2.2 c-kit+细胞比例 对照组的 BM-MNCs中 ckit+细胞比例为 3.8%;心梗组第 3、7天分别为16.6%、6.8%。见图 2。

图1 两组BM-MNCs中c-kit mRNA表达水平

图2 两组BM-MNCs中c-kit+细胞比例(流式细胞术)

2.3 c-kit+细胞阳性率 对照组少量单个核细胞为c-kit+，阳性率为4.0%，心梗组第3、7天 c-kit+阳性率分别为20.4%、8.25%。从 BM-MNCs中用磁珠分选出的c-kit+细胞染色几乎全部细胞呈阳性染色。

2.4 细胞增殖情况 c-kit+细胞及c-kit-细胞均有增殖现象存在，可见 c-kit+ki67+、c-kit+ki67-细胞群。心梗组第3天c-kit+细胞增殖更加活跃。见图3。

图2 两组BM-MNCs中c-kit+细胞比例(流式细胞术)

3 讨论

急性心肌梗死后心脏泵血能力受到影响，梗死区域的心肌细胞由于缺血损伤而失去功能［1，2］。一直以来，哺乳动物的心脏被认为是一个终末分化器官［3］，而存在于心脏中的心肌细胞也被认为是终末分化细胞，因心肌无法再生导致心力衰竭的发生［4］。因此，心肌梗死治疗以恢复正常冠状动脉血流、挽救梗死的心肌细胞和最大限度修复心肌功能为目标［5，6］。常用方法一般是药物和介入治疗。近年研究发现，以c-kit为细胞表面标记物的心脏干细胞可以修复损伤心肌［7，8］，但是心脏干细胞数量不足［9］。应用其他组织来源的c-kit+细胞成为研究热点［10］。骨髓干细胞具有与心脏干细胞类似的作用，成为新的选择［11，12］。

研究表明，心肌梗死后心脏中的c-kit+细胞数量有所增加，且有约74%的c-kit+细胞来源于骨髓［13］，表明心肌梗死后骨髓中的c-kit+干细胞比例增加。本研究发现，小鼠急性心肌梗死后骨髓中的c-kit+干细胞的比例高于对照组，提示心梗后小鼠骨髓中c-kit+细胞水平对损伤产生反应，应激性增加;心梗组第 3、7天 c-kit+细胞分别为 16.6%、6.8%，提示急性心肌梗死后小鼠BM-MNCs中的ckit+干细胞比例呈应激性增加，并且随时间推移逐渐降低。由于心肌梗死造成的缺血损伤对骨髓起到了动员作用，骨髓中大量增加的c-kit+干细胞执行心肌修复功能。而急性期过后，在心梗后第7天时，c-kit+干细胞比例相对于第3天时有所下降，表明损伤应激引起的骨髓动员现象可能主要存在于心梗1周以内，并且以第3天时最活跃。

骨髓中c-kit+细胞的比例高于对照组，可能归因于c-kit+细胞的旺盛增殖。本研究发现，心梗组第3天BM-MNCs中c-kit+干细胞数量多、应激活跃，提示心梗后第3天BM-MNCs中c-kit+干细胞处于活跃的增殖状态，而c-kit-细胞群存在增殖现象但是比例不多，提示心肌缺血损伤后骨髓的动员主要针对c-kit+干细胞。

综上所述，急性心肌梗死后，受到心肌缺血损伤的应激影响，小鼠BM-MNCs中c-kit+细胞的比例增高，出现增殖现象。今后的研究应针对提高c-kit+细胞增殖以增加c-kit+阳性细胞的数量和比例。

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