四氧嘧啶制备犬糖尿病模型的最佳剂量探讨

成 雪，王意忠

(北京大学航天临床医学院，北京100049)

糖尿病下肢血管病变是糖尿病严重慢性并发症之一，严重影响患者生活质量［1～4］。目前，在糖尿病下肢血管病变研究领域，大型实验动物糖尿病模型的制备剂量尚无统一结论。由于犬体积大，血管粗大，其饮食习惯、胰腺解剖及功能与人类相似，因此犬糖尿病模型能够更好地模拟人类糖尿病发病机制。四氧嘧啶价格低廉，用药量少，操作简便，是目前最常用的糖尿病模型制备药物［5］。2012年12月～2013年1月，我们采用梯度剂量的四氧嘧啶经下肢浅静脉注射给药建立犬糖尿病模型，探讨制备犬糖尿病模型的最佳给药剂量。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 同一批次Beagle犬30只，雄性，体质量(15±1.6)kg，由北京芳元缘养殖场提供(动物合格证:SCXK京2009-0014)。四氧嘧啶由美国Sigma公司提供(批号:BCBB7829)。生理盐水由北京大学航天临床医学院提供。罗氏ACCU-CHEK血糖测试仪及其血糖试纸由北京念友医疗器械有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 将30只Beagle犬随机分为6组，分别为对照组及第1、2、3、4、5组。各组犬体质量、血糖水平等差异无统计学意义。

1.2.2 糖尿病模型制作 Beagle犬适应性喂养1周，饮食三餐定量后，连续3 d监测每日4次(即空腹、早餐后2 h、午餐后2 h、晚餐后2 h)血糖，禁食12 h，自由饮水。新鲜配制的200 g/L的四氧嘧啶溶液，4℃避光操作，1～5组分别经下肢浅静脉注射四氧嘧啶 40、45、50、55、60 mg/kg，20 s 内推注完毕。对照组经下肢浅静脉注射等量生理盐水。

1.2.3 观察指标 分别于给药前、给药后0.5、4、12、24、48 h观察各组一般情况，采用罗氏血糖仪监测随机血糖，观察给药后血糖变化情况。48 h后随机血糖≥11.1 mmol/L且持续2周维持在此水平表明糖尿病犬造模成功［6］。观察各组糖尿病模型的成模情况，计算成模率。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，实验数据经正态分布检验后以±s表示，均数间的比较经方差齐性检验后以单因素方差分析统计。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 给药后对照组及第1、2、3组一般状态良好，精神佳，未见任何异常反应。第4、5组给药1 h后出现呕吐反应伴精神不振、心率加速等症状，尤以第5组反应最为剧烈;血糖仪显示“Low”(即血糖过低)，及时静脉推注50%葡萄糖注射液5 mL后4组症状开始缓解。第5组5只犬及第4组1只犬造模后12 h内均多次呕吐，状态萎靡，24 h时突然呈晕厥状，全身剧烈抽搐，疑为药物性肝损伤合并糖尿病酮症酸中毒，及时用保肝、补液、胰岛素、保胃及碳酸氢钠中和酮症酸等治疗后缓解。48 h后第4组中1只犬及第5组中4只犬相继出现呕吐、精神低迷状态，间断饮食，至造模后第20天死亡。

2.2 成模率 第1、2、3、4、5组及对照组成模率分别为 0(0/5)、40%(2/5)、100%(5/5)、80%(4/5)、20%(1/5)。

2.3 给药后48 h内血糖水平变化 见表1。

表1 各组给药后48 h内血糖水平变化(±s，mmol/L)

表1 各组给药后48 h内血糖水平变化(±s，mmol/L)

注:与同组造模前比较，▲P ＜0.05;与同组造模后0.5 h比较，*P＜0.05;与同组造模后4 h比较，﹟ P＜0.05;与同组造模后12 h比较，★P ＜0.05

组别 n 造模前 造模后0.5 h 造模后4 h 造模后12 h 造模后24 h 造模后48 h第 1 组 5 4.1 ±0.4 3.0 ±0.3 5.6 ±1.4 4.5 ±1.1 5.0 ±1.0 4.6±0.5第2 组 5 3.8 ±0.7 2.9 ±0.8 6.2 ±2.1 5.5 ±1.5 7.3 ±2.5 10.0 ±3.2第3 组 5 4.2 ±0.9 2.1 ±1.0▲ 12.0 ±2.7* 2.4 ±1.9﹟ 11.3 ±1.5 11.5 ±1.4第4 组 5 3.7 ±1.1 1.6 ±0.9▲ 23.2 ±3.1* 2.1 ±2.8﹟ 21.3 ±4.5 21.6 ±6.3第5组 5 4.0 ±0.5 1.5±0.7▲ 21.6±2.5* 1.3 ±1.7﹟ ≥33.3 ≥33.3对照组 5 3.9 ±0.5 3.7 ±0.9 3.5 ±0.2 3.8 ±0.8 4.6 ±1.1 4.0±0.5

3 讨论

四氧嘧啶是一种胰岛β细胞毒剂，可通过产生超氧自由基选择性损伤动物胰岛β细胞DNA，造成胰岛β细胞功能发生障碍导致血糖升高［7～11］。本研究发现，四氧嘧啶致糖尿病过程可分为4个时相:开始时15～30 min血糖降低，2～4 h后血糖升高，6～12 h血糖再次显著下降，至18～24 h后血糖基本稳定，出现持久的高血糖相。其机制除四氧嘧啶导致胰腺组织损伤外，可能与其对肝脏功能造成损害有关。因此四个时相机制可能涉及胰岛β细胞的破坏及肝脏功能损害对血糖的影响两个方面。低血糖相的机制可能为:①四氧嘧啶在动物体内起效迅速，短期内可直接破坏胰岛β细胞，胰岛β细胞大量变性坏死，释放大量胰岛素导致血糖急剧下降。②药物致肝脏功能损伤，肝脏糖原的合成和分解受抑制。高血糖相的机制可能为:①药物暂时性刺激导致肾上腺交感神经系统动员大量葡萄糖。②药物刺激肝脏，肝脏分解大量肝糖原入血。③后期由于胰岛β细胞发生不可逆性损害，残留的胰岛β分泌胰岛素不足导致持久高血糖。由于应用四氧嘧啶造模存在小剂量无效、大剂量致死的现象，为了避免四氧嘧啶成模前引起的动物在高血糖和低血糖时相的死亡，我们密切观察犬的一般状态并及时监测血糖，分别在其高血糖时相皮下注射胰岛素，低血糖时相给予50%葡萄糖静推，很好地控制了成模前24 h内的死亡率。

本研究发现，当剂量小于40 mg/kg时，血糖水平与对照组相当，差异无统计学意义，表明造模失败，考虑此剂量的四氧嘧啶能够导致胰岛β细胞部分破坏，胰岛素分泌减少，但是没有达到引起血糖升高的阈值。当剂量达到45 mg/kg时有40%的造模成功率，未成模犬出现了血糖的波动，但是未达到糖尿病模型标准，可能与胰岛β细胞自身的修复有关。当剂量为55～60 mg/kg时，犬出现一系列酮症及肝损伤的症状，最终大部分死亡，可能与大剂量四氧嘧啶对胰腺组织及肝脏造成了严重的损伤、胰岛素分泌严重不足引起酮症酸中毒及肝脏功能受损有关。当剂量为50 mg/kg时，造模成功率为100%，犬的一般状态良好，未见酮症及肝损伤的症状出现。因此，当四氧嘧啶剂量为50 mg/kg时，糖尿病造模成功率最高，为Beagle犬糖尿病模型的最佳剂量。

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