c-myc、HIF-1α在骨巨细胞瘤组织中的表达及其与临床、生物学行为的关系

马 琨，郭建刚

(河南省洛阳正骨医院，河南洛阳471002)

骨巨细胞瘤(GCTB)是常见且具有潜在恶性的骨肿瘤，大块切除是其治疗的理想方案，但其术后侵袭性生长和复发率为40% ～50%，且易发生肺转移。研究表明，原癌基因c-myc表达升高在肿瘤发生、发展中起重要作用。肿瘤的演进和转移依赖于新生血管生成，c-myc可调控下游基因缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)［1］，促进下游血管内皮生长因子(VEGF)表达，诱导肿瘤血管形成，促进实体肿瘤自身的生长、转移和化疗耐药［2］。目前，有的学者将c-myc和HIF-1α作为评估乳腺癌等实体瘤生物学行为和预后的标志物［3］，但二者在GCTB组织中是否呈高表达、其表达是否与肿瘤进展有关，国内外报道甚少。为此，我们对c-myc、HIF-1α在GCTB组织中的表达及其与临床、生物学行为的关系进行了初步研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2006～2013年在我院行GCTB手术的80例患者的病理标本，男54例、女26例，年龄18～60岁、平均48.3岁。病变位于股骨下端34例、胫骨上端25例、桡骨远端12例、桡骨近端4例、骶骨3例、骨盆2例，均经临床、病理、X线联合检查确诊。Campanacci影像学分期为Ⅰ期18例，Ⅱ期34例，Ⅲ期28例;治愈65例，复发15例。除2例复发后失访外，均获随访，随访时间平均60个月。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 取患者的GCTB组织蜡块4 μm行连续切片，进行免疫组化染色。主要步骤:肿瘤组织石蜡切片，58℃烤片过夜;常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化;柠檬酸盐行高温、高压抗原修复;3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，分别滴加c-myc、HIF-1α、CD34单克隆抗体，室温孵育1 h;滴加生物素标记二抗孵育15 min;DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。免疫组化试剂均为福州迈新生物公司产品。

1.2.2 结果判断标准 c-myc主要定位在细胞核或细胞质，呈棕黄色或棕褐色。HIF-1α主要定位于细胞核，出现棕黄色或棕褐色颗粒样物质为阳性。高倍镜下随机观察5个视野，每个视野观察细胞数不少于200个。根据细胞核染色强度及染色细胞百分率进行评分:①染色强度:基本不着色为0分，着淡黄色为1分，着棕黄色为2分，着棕褐色为3分。②阳性细胞所占百分率:≤5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为 3分，≥75%为4分。每张切片染色强度得分与阳性细胞百分率得分相乘为其最后得分，0～1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，≥6分为强阳性(+++)。采用CD34单抗标记新生血管内皮，CD34阳性判断为细胞膜和细胞质着深棕色颗粒。微血管密度(MVD)计数:GCTB内任何一个孤立的棕黄色细胞或细胞簇均认为是一条单独血管，先在低倍视野内找到肿瘤组织内微血管最丰富区域，即肿瘤内微血管的“热点”，再于高倍视野下计数3个视野内的微血管数目，取其平均值进行分析。

1.2.3 统计学方法 采用 SPSS12.0统计软件，计量数据用±s表示，组间比较用单因素方差分析，多重比较用t检验，等级资料比较行秩和检验，HIF-1α、c-myc表达与MVD值行Spearman等级相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-myc、HIF-1α表达与 GCTB患者临床病理参数的关系 见表1。c-myc阳性物质主要表达于细胞核和(或)细胞质，HIF-1α阳性物质呈棕黄色颗粒状，主要表达于细胞核。患者的c-myc、HIF-1α阳性表达率分别为55%(44/80)、50%(40/80)。

表1 c-myc、HIF-1α表达与GCTB患者临床病理参数的关系［例(%)］

2.2 HIF-1α表达强度与MVD计数的关系 CD34阳性表达定位于肿瘤间质小血管及微血管内皮细胞胞质中，CD34阳性细胞可见瘤组织中的微血管为单个或成簇出现。HIF-1α表达阴性、阳性者GCTB组织中的 MVD 计数分别为(28.47 ±4.31)、(46.85 ±7.72)个/mm2，其中 HIF-1α 表达(－ )、(+)、(++)、(+++)者分别为 40、13、16、11 例，其 GCTB 组织中的 MVD 计数分别为(28.47 ±4.31)、(37.29 ±7.62)、(48.58 ± 6.97)、(54.69 ± 8.59)个/mm2;HIF-1α表达(++)、(+++)者的 MVD数目高于(－)、(+)者，P 均 ＜0.05;HIF-1α 表达强度与MVD 值呈高度正相关(r=0.996，P ＜0.01)。

2.3 HIF-1α、c-myc表达强度与GCTB患者预后的关系 见表2。

表2 HIF-1α、c-myc表达强度与GCTB患者预后的关系

3 讨论

研究发现，GCTB经过外科手术治疗后仍有20% ～50%的复发率，部分患者可发生肺转移［4］。近年来，评估GCTB生物学行为和判断其预后的可靠肿瘤标志物成为临床研究的热点。c-myc蛋白是由myc家族编码的转录因子，人类c-myc基因定位于Ⅷ染色体上，由3个外显子及2个内含子组成。Ⅰ外显子只起调节作用，Ⅱ、Ⅲ外显子是转译区，编码包含439个氨基酸残基的蛋白质。该基因表达在细胞生长调控中发挥双向作用，既可刺激细胞增殖，也可促进细胞凋亡。李灼日等［5］研究表明，c-myc表达特征可反映胆管癌的生物学行为和恶性程度。林称意等［6］研究表明，c-myc表达强度是判断食管癌细胞过度分化及术后复发的关键指标。本研究显示:①c-myc在GCTB组织中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小及发病部位无统计学差异，提示上述参数不能作为判断GCTB侵袭及复发的指标。②随着Companacci分期逐渐增高，c-myc表达逐渐升高，其中Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅰ期与Ⅲ期比较均有统计学差异，且复发者的阳性表达率高于治愈者;提示c-myc可促进GCTB细胞增殖，并与肿瘤复发、转移及预后不良有密切关系。有学者对骨肉瘤患者的组织标本进行c-myc原位杂交并作临床随访，发现c-myc表达阳性率为80%，其中肺转移死亡者的阳性率高于存活3年以上者;提示c-myc过度表达与间叶来源肿瘤的发生、发展有关，其在分化差的区域表达较高，而在分化较好的区域表达则相反［7］。

实体性肿瘤的生长依赖于血管的生成，丰富的血管可为其提供营养物质条件，但肿瘤细胞增殖过快而血运无法满足其生长需求时，就会形成局部缺氧的微环境，在肿瘤内部出现为耐受缺氧而表达的HIF。HIF是一种双聚复合体，有 HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α三个亚型，由不同的基因编码。低氧时HIF-1α与缺氧反应元件结合，可提高VEGF mRNA的稳定性，促进VEGF表达上调，增加供血、供氧、供能，改善恶性肿瘤因组织增生过快造成的局部组织缺氧及供能与耗能失衡，促进肿瘤生长和转移［8］。另外，某些化疗药在氧分压正常时也促进HIF-1α累积，使细胞耐药［9］。本研究显示:①HIF-1α在GCTB组织中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小及发病部位无统计学差异，提示上述参数不能作为判断GCTB侵袭及复发的指标。②HIF-1α阳性率为50%，Companacci影像学分期越高，其HIF-1α阳性率越高，且复发者的阳性率高于治愈者。提示HIF-1α表达强度与GCTB细胞的生长、浸润、转移有关。HIF-1α可能通过以下途径调节细胞生物学行为:①HIF-1α与缺氧反应元件中的共有序列结合，在转录水平上增加VEGF表达，提高VEGF mRNA的稳定性，上调VEGF蛋白表达水平，增加供血、供氧、供能，促进肿瘤生长、转移［10］;②抑制成骨细胞分化;③诱导其下游因子 IL-6和 TNF-α，通过 OPG/RANK/RANKL系统加速破骨细胞生成，促进骨吸收和骨破坏［11］。

HIF-1α是c-myc的下游调节物，c-myc通过调控HIF-1α参与肿瘤新生血管形成，对肿瘤细胞的生长和转移发挥促进作用［12］。本研究发现，c-myc、HIF-1α与CD34在GCTB组织中的表达呈正相关，复发者的c-myc、HIF-1α双阳性表达率高于治愈者。由此可见，HIF-1α与c-myc存在调节机制，两者在促进GCTB进展中可能发挥协同作用，可作为评估GCTB生物学行为和判断患者预后的重要指标。

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