白藜芦醇通过诱导自噬保护糖尿病肾病大鼠肾功能的研究

李春花，张 英，李可心，周 磊

白藜芦醇通过诱导自噬保护糖尿病肾病大鼠肾功能的研究

李春花1，张 英1，李可心1，周 磊2＊

（1.吉林省人民医院内分泌科，吉林长春130021；2.长春中医药大学附属医院病理科）

目的建立大鼠糖尿病肾病模型，探讨白藜芦醇其肾功能保护的机制。方法建立大鼠糖尿病肾病模型，生化分析法检测血糖，酶联免疫法测定24小时尿白蛋白排泄率，肌酐清除率，Western blot法检测自噬标志蛋白LC3－II和Beclin1水平变化。结果白藜芦醇治疗对糖尿病肾病大鼠血糖无明显影响（P＞0.05），但可明显降低糖尿病肾病大鼠肌酐清除率和24h尿白蛋白量（P＜0.05），提高LC3－II和Beclin1蛋白表达。结论白藜芦醇可通过活化自噬功能发挥对糖尿病大鼠肾脏功能的保护作用。

糖尿病肾病；自噬；白藜芦醇

Key words：diabetic nephropathy；autophagy；Resveratrol

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1920）

在糖尿病的血管并发症中，糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是终末期肾病（end－stage renal disease）的主要原因，也是心血管疾病的独立风险因素［1］。然而，在临床治疗中，血糖稳态控制的困难及RAS抑制剂治疗难以完全阻断肾病进展，都迫切需要对DN发病机制进行更为深入的研究，促进新的DN治疗策略的发展。国内外已有大量研究证明，白藜芦醇对糖尿病的多种并发症具有良好的治疗作用，但机制尚不完全清楚［2］。SIRT1作为三级组蛋白去乙酰化酶，其活性变化可影响线粒体代谢和功能［3］。自噬是高度保守的，并受严密调控的，参与长寿命蛋白和受损细胞器降解的过程，作为是线粒体稳态的关键调节因子之一发挥重要的保护机制［4］。本研究建立糖尿病肾病大鼠动物模型，观察给予白藜芦醇干预后大鼠肾组织中自噬标志蛋白的表达变化，探讨其对肾脏的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1动物健康雄性Wistar大鼠45只，体重（200 ±20）g。随机对照组（C组）15只，糖尿病肾病组（DN组）15只，白藜芦醇治疗组（RSV组）15只。

1.2方法

1.2.1 试剂与仪器 白藜芦醇（购自美国Sigma公司），一抗二抗（购自美国Santa cruz公司，全自动生化分析仪（日本Olympus公司）。

1.2.2 建立糖尿病肾病大鼠模型 参考文献进行少量修改，建立2型DN大鼠模型。健康Wistar大鼠，高脂饮食，腹腔一次性注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）50mg／kg建立2型糖尿病模型，（空腹血糖≥16.7mmol／L，尿糖＋＋以上），继续喂养12周，根据血尿生化学检测、组织形态学检测，确立糖尿病肾病大鼠模型建立成功。

1.2.3 给药方法 C组正常大鼠生理盐水5ml／kg／d灌胃。糖尿病肾病大鼠造模成功后，DN组生理盐水5ml／kg／d灌胃，RSV组白藜芦醇20mg／kg／d灌胃。所有动物均连续给药12周，于治疗结束后，收集24小时尿标本，腹腔麻醉，取血标本和肾组织标本。

1.2.4 检测指标 全自动生化分析仪检测肌酐清除率、尿蛋白浓度。尿蛋白定量计算公式：24h尿蛋白定量（mg／d）＝尿蛋白浓度（mg／L）×24h尿量（L）

1.2.5 肾组织形态学检测 组织10%中性福尔马林固定24h，常规石蜡包埋，HE染色镜下观察。

1.2.6 自噬标志蛋白表达变化 提取大鼠肾组织蛋白。Western blot法检测自噬标志蛋白LC3－II和Beclin1表达变化。

1.3统计学处理方法

采用SPSS16.0软件分析。计量资料实验数据以（均值±标准差）表示，单变量配对资料之间的比较采用配对样本t检验。

2 结果

2.1白藜芦醇对DN大鼠肌酐清除率和24 h尿白蛋白的影响

各组大鼠肌酐清除率结果显示，与C组相比，DN组大鼠肌酐清除率达到糖尿病肾病模型标准要求。与DN组相比，白藜芦醇治疗可明显降低糖尿病肾病大鼠肌酐清除率（P＜0.05）。24h尿白蛋白结果表明，与DN组相比，白藜芦醇治疗可明显降低糖尿病肾病大鼠24h尿白蛋白量（P＜0.05）。（见表1）

表1 白藜芦醇对DN大鼠肌酐清除率和24 h尿白蛋白的影响（x—±s，n＝15）

2.2白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠肾组织形态学影响

HE染色结果显示，与C组相比，DN组大鼠肾小球毛细血管充血，系膜区增厚，系膜基质增多，足突细胞肥大。白藜芦醇组大鼠肾组织炎症较轻，肾小球管型少见，肾小球充血减少，系膜区增厚与系膜基质增多与DN组相比明显减轻。（见图1）

2.3白藜芦醇对糖尿病大鼠肾脏组织中自噬标志蛋白LC3－II和Beclin1的影响

Western blot结果显示，与C组相比，自噬标志蛋白Beclin1和LC3－II在DN组无明显变化。与DN组相比，RSV组Beclin1和LC3－II明显增高（见图2）。

3 讨论

图1 白藜芦醇对糖尿病肾病大鼠肾组织形态学影响

图2 白藜芦醇对糖尿病大鼠肾脏组织中自噬标志蛋白LC3－II和Beclin1的影响

糖尿病（diabetes mellitus）是慢性代谢性疾病，其发病率在全世界范围内呈持续增长势头。糖尿病患者长期的高血糖状态是促进血管病变和功能障碍的根本因素，引起多种糖尿病并发症，是糖尿病患者主要的致残致死原因。在临床治疗中，血糖稳态控制的困难及RAS抑制剂治疗难以完全阻断肾病进展，都迫切需要对DN发病机制进行更为深入的研究，促进新的DN治疗策略的发展。

白藜芦醇是一种从植物中提取出的多酚醇类物质，是SIRT1的天然激活剂。而SIRT1作为代谢相关疾病治疗研究的热点，其在肾脏活化可能成为新的治疗靶点，以抵抗多种因素导致的肾脏疾病包括DN的发生发展［3］。我们基于糖尿病肾病大鼠动物模型的实验结果显示，白藜芦醇可明显降低糖尿病肾病大鼠肌酐清除率，降低24h尿白蛋白量。HE染色结果显示，白藜芦醇组大鼠肾组织炎症较轻，肾小球管型少见，肾小球充血减少，系膜区增厚与系膜基质增多与DN组相比明显减轻，均表明白藜芦醇具有明显的肾脏保护作用。

自噬的异常变化参与代谢性相关疾病包括糖尿病和肾病的发病过程［5］。根据肾损伤模型实验，自噬系统在足细胞、肾小管细胞中非常重要。足细胞存在显著的高水平的组成型自噬，在足细胞特异性缺失自噬相关蛋白Atg5的老年鼠易引起肾小球疾病，并伴有氧化和泛素化蛋白聚集、内质网应激和蛋白尿，最终导致足细胞损失和肾小球硬化症［6］。小鼠Atg5缺失可表现出对药物（嘌呤霉素和阿霉素）诱导的肾小球损伤敏感性增加［7］。糖尿病动物肾脏的自噬缺陷可使小管细胞在缺氧和ER stress时易损，导致DN进展。因此，自噬活化可能成为晚期DN的治疗选择。我们在蛋白水平检测了自噬标志蛋白Beclin1和LC3－II的表达变化，发现在白藜芦醇干预下糖尿病肾病大鼠肾组织中，Beclin1和LC3－II明显增高，表明白藜芦醇可有效活化自噬。

结合我们的实验结果和现有文献研究，白藜芦醇可通过活化自噬发挥对糖尿病大鼠肾脏功能的保护作用

［1］侯振江，牟兆新，周秀艳，等.尿微量白蛋白在糖尿病和高血压肾病早期诊断中的应用［J］.中国实验诊断学，2010，14（9）：1389.

［2］Kume S，Thomas MC，Koya D.Nutrient sensing，autophagy，and diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2012，61（1）：23.

［3］Kitada M，Kume S，Takeda－Watanabe A，et al.，Sirtuins and renal diseases：relationship with aging and diabetic nephropathy［J］.Clin Sci（Lond），2013，124（3）：153.

［4］Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，et al.Autophagy fights disease through cellular self－digestion［J］.Nature，2008，451（7182）：1069.

［5］Wang Y，Li YB，Yin JJ，et al.Autophagy regulates inflammation following oxidative injury in diabetes［J］.Autophagy，2013，9（3）：272.

［6］Kume S，Thomas MC，Koya D.Nutrient sensing，autophagy，and diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2012，61（1）：23.

［7］Hartleben B，Gödel M，Meyer－Schwesinger C，et al.Autophagy influences glomerular disease susceptibility and maintains podocyte homeostasis in aging mice［J］.J Clin Invest，2010，120（4）：1084.

Resveratrol protects renal function through inducing autophagy in diabetic nephropathy rats

LI Chun－hua，ZHANG Ying，LI Ke－xin，et al.（Department of Endocrinology，People's Hospital of Jilin Province，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the mechanism of renal protective effects of resveratrol on diabetic rats.MethodsEstablishing DN rat model by streptozotocin biochemical analysis of blood glucose，measured 24－hour urinary albumin excretion rate by enzyme－linked immunosorbent assay，creatinine clearance rate，RT－PCR was used to detect mitochondrial fission，fusion gene transcripts levels，mitochondrial membrane potential detection.ResultsResveratrol treatment had no significant effects on blood glucose in DN rats（P＞0.05），but significantly reduced creatinine clearance and 24hurinary albumin（P＜0.05），and increased Beclin1and LC3－II protein expression.ConclusionResveratrol plays a protective role on renal function in DN rats by affecting autophagy function.

R587.2

：A

李春花（1978－），女，硕士，主治医师，主要从事糖尿病及其并发症的研究；周磊（1978－），男，博士，主治医师，主要从事肾脏疾病病理研究。

2014－04－18）

1007－4287（2014）12－1920－03

吉林省科技厅资助项目（No.20140520009JH）

＊通讯作者