荧光原位杂交技术检测非小细胞肺癌EGFR基因状态及与VEGF、D2－40、Ki－67表达相关性临床意义研究

韩 影，刁文卓，陈 萍，程 薇

荧光原位杂交技术检测非小细胞肺癌EGFR基因状态及与VEGF、D2－40、Ki－67表达相关性临床意义研究

韩 影1，刁文卓2，陈 萍1，程 薇1

（1.吉林市中心医院病理科，吉林吉林132011；2.吉林市中心医院神经外科）

肺癌是严重危害人类生命安全的最常见的恶性肿瘤之一，其中以非小细胞癌居多，近年来其发病率和死亡率呈明显上升趋势。虽然近年来在诊断方法和治疗手段上有了很大发展，但是仍然不能得到满意的治疗效果，寻找有效的治疗手段一直是肿瘤学界研究的方向。近年来出现的新的治疗方法，即靶向治疗，使个体化成为可能，明显提高了肿瘤治疗的疗效。在肺癌靶向治疗中，两种小分子酪氨酸激酶抑制剂（即Iressa和Tarceva）能特异地抑制具有EGFR基因变异的非小细胞肺癌（NSCLC）癌细胞的生长，使病人的预后能够得到改善。本研究通过荧光原位杂交技术对非小细胞癌EGFR基因状态进行检测，同时通过免疫组化染色检测VEGF、D2－40、Ki－67的表达情况，进一步对两者之间的相关性进行研究，从而为临床诊断和治疗提供有效的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料收集我院2008－2012年间病理科诊断为肺非小细胞癌的存档蜡块80例，年龄34－75岁，中位年龄55岁。其中男性45例，女性35例，所有病例均按照国际抗癌联盟UIC的诊断标准进行病理分期，其中鳞癌26例，腺癌54例，以高分化21例、中分化36例和低分化23例进行分组，取其中20例癌旁正常组织作为对照组，术前均未进行放疗和化疗。

1.2方法

1.2.1 主要试剂EGFR基因扩增检测试剂盒购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。VEGF鼠抗人单克隆抗体、D2－40鼠抗人单克隆抗体、Ki－67鼠抗人单克隆抗体，SP染色试剂盒和DAB试剂均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2.2 主要仪器 荧光显微镜，免疫组化配套仪器，石蜡切片机，电热恒温干燥箱，光学显微镜。

1.2.3 EGFR杂交 确诊为肺非小细胞癌的肺组织石蜡包埋样本，切片厚度2.5μm，固定时间8－24 h之间，操作流程均按照说明书进行操作。

1.2.4 免疫组化染色 所有切片均为2.5μm厚连续切片，取一组行HE染色，再行SP免疫组化法检测VEGF、D2－40和Ki－67三项指标。

1.2.5 结果判定 EGFR检测结果计数100个细胞，统计ratio值，若ratio＜2为阴性结果，提示该样本无EGFR基因扩增，若ratio值＞2为阳性结果，提示样本中EGFR基因发生扩增。采用半定量双盲法，根据显微镜下免疫组化阳性细胞染色进行评价，VEGF阳性反应为细胞膜或细胞浆呈棕褐色，D2－40阳性反应为细胞质和细胞膜呈棕褐色，Ki－67阳性反应为细胞核呈棕褐色、颗粒状。每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，阳性细胞数≥50%为强阳性（＋＋＋），49%－25%为阳性（＋＋），25%－5%为弱阳性（＋），＜5%为阴性（－）。

1.2.6 统计方法 所得数据采用平均值±标准误（MEAN±SE），采用Graph Pad Instat5.0统计软件进行数据分析，多组间用单因素方差分析，两组间比较采用Student’s t检验。认为P＜0.05差别有统计学意义。

2 结果

2.1EGFR在肺非小细胞癌中的表达研究表明若ratio值＞2为EGFR阳性，提示样本中EGFR基因发生扩增。我们的研究结果为，低分化组的阳性率明显高于中分化与高分化组（P＜0.01，n＝21－36），但是高分化与中分化之间没有明显差异。说明EGFR的阳性表达与非小细胞肺癌的恶性程度呈正相关，可以作为肿瘤分化不良的标志物，其表达高的肿瘤细胞可能具有更强的增殖能力（表1）。

2.2VEGF在肺非细胞癌中的表达VEGF免疫组化阳性反应为细胞膜或细胞浆呈棕褐色，我们的结果显示高分化组与中分化组和低分化组之间具有明显差异（P＜0.001，n＝21－36），中分化组与低分化组之间也有很大差异（P＜0.05，n＝21－36）。以上结果表明VEGF的阳性表达与非小细胞肺癌的恶性程度呈正相关，其恶性程度越高阳性率越高（表2）。

2.3D2－40在肺非小细胞癌中的表达D2－40阳性反应为细胞质和细胞膜呈棕褐色，我们的结果显示在非小细胞肺癌组织内有阳性表达D2－40在高分化组与中分化组和低分化组之间具有明显差异（P＜0.001，n＝21－36），但是中分化与低分化组之间没有差异，说明随着恶性程度升高D2－40表达阳性增强（表2）。

2.4Ki－67在肺小细胞癌中的表达Ki－67阳性反应为细胞核呈棕褐色、颗粒状，我们的结果显示非小细胞肺癌与癌旁正常肺组织中均有Ki－67增殖抗原表达。Ki67蛋白在非小细胞肺癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，并且高分化组的阳性率明显低于中分化和低分化组（P＜0.001，n＝21－36），中分化又低于低分化组（P＜0.05，n＝21－36）（表2）。

2.5EGFR与VEGF、D2－40和Ki－67之间的关系我们的研究表明VEGF、D2－40和Ki－67在低分化组均高表达，说明三者随着肿瘤的恶性度增加而增加，且EGFR与肿瘤的恶性度相关，说明EGFR与VEGF、D2－40和Ki－67这四者的表达可能存在某种关系，可以指导临床肺非小细胞癌的诊断和治疗。

表1 EGFR在不同病理学分级中的表达

表2 肺非小细胞癌在不同病理学分级中的表达

3 讨论

随着科技的发展，医疗水平的进步，肺癌的治疗手段也有了一定的改进，但是由于空气污染、吸烟等多种问题，肺癌的发病率也呈逐年上升趋势。其中非小细胞型肺癌约占所有肺癌的85%－90%，所以近年非小细胞肺癌成为研究的焦点，以期找到更为有效的早期临床诊断方法和治疗手段，从而延长患者生命并提高其生活质量［1］。

3.1 表皮生长因子受体EGFR是一种受体酪氨酸激酶，原癌基因c－erbB1的表达产物。EGFR广泛分布于人体中，对细胞的增殖分化有重要调控作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生［2］。已经有大量研究表明，EGFR基因与多种恶性肿瘤的发生和发展有密切关系，其表达水平的升高可以促进细胞的异型增殖，造成恶性肿瘤的发生，并且其表达水平的高低与肿瘤的程度具有相关性［3］。目前临床资料表明EGFR抑制剂Erbitux（cetaximab，西妥昔）单抗抗肿瘤药物可以结合肿瘤细胞EGFR位点，抑制肿瘤细胞增殖旁路，抑制肿瘤生长并促使其凋亡［4］。本实验表明EGFR的阳性表达与非小细胞肺癌的恶性程度呈正相关，可以作为肿瘤分化不良的标志物，其表达高的肿瘤细胞可能具有更强的增殖能力。因此，EGFR可以作为非小细胞肺癌恶性程度的生物学指标，也可以作为判断预后的重要参数。

3.2 在肿瘤的发生和发展过程中，血管的生成起到重要作用，任何种类的肿瘤都需要血液来提供氧气和营养支持，VEGF在血管的生成过程中起到重要作用，其在多种肿瘤的发生、发展以及转移中发挥着重要作用。有研究显示，抗VEGF抗体的应用，可以明显抑制肿瘤的［5］。本实验研究结果显示VEGF的阳性表达与肿瘤的恶性程度呈正相关，恶性程度高的低分化肿瘤细胞内表达较高，恶性程度低的中、高分化肿瘤细胞内表达相对较低，同时本实验还观察到，不但肿瘤细胞胞浆内有棕黄色染色，新生血管旁也有较强染色，这些现象说明VEGF是一种重要的血管生长因子，说明VEGF在非小细胞肺癌的肿瘤发生过程总起到重要作用。

3.3 D2－40首次是作为淋巴管内皮细胞特异性标记物应用于肿瘤淋巴管形成的研究，其表达于淋巴管内皮细胞内，但是并在血管内皮细胞无表达，因此其有助于淋巴管内皮细胞源性肿瘤诊断以及判断其

他肿瘤组织是否发生淋巴道浸润和转移，研究表明其密度越高，转移机会越大，预后越差［6］。随着研究不断深入，人们发现D2－40在多种肿瘤病理中还具有一些重要的诊断价值。目前发现98%睾丸精原细胞瘤弥漫性强阳性表达D2－40，同时其在雪旺氏瘤、富于细胞性神经鞘瘤和约75%上皮样恶性周围神经鞘膜肿瘤中呈弥漫性强阳性表达，D2－40作为一种免疫试剂可表达于多种类型细胞和不同类型肿瘤［7］。本研究结果显示D2－40在非小细胞肺癌组织内有阳性表达，并且随恶性程度升高表达阳性增强，这些现象说明D2－40可以作为非小细胞肺癌的标志物，并且可以作为判断临床预后的参数之一。

3.4 Ki－67是存在于增殖细胞核的一种非组蛋白核蛋白，其在除了G0期以外的其余细胞增殖周期内均有表达，并且在有丝分裂后蛋白含量迅速减少，新型抗体MB－1可以识别G1、S、G2、M期的Ki－67抗原表达，所以MB－1可以反映细胞群体增殖活性的客观指标［8］。因此，本研究试图通过检测Ki－67在肺癌组织中表达，判断其与肿瘤的恶性生物学特性的相关性。结果显示：非小细胞肺癌与癌旁正常肺组织中均有Ki－67增殖抗原表达，Ki67蛋白在肿瘤组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，说明Ki－67增殖抗原能间接反映恶性肿瘤的无限增殖活性。

3.5 本实验研究发现EGFR的表达与非小细胞肺癌的分级有统计学意义（P＜0.01），表明EGFR可作为反映非小细胞肺癌增殖能力的重要指标，在促进非小细胞肺癌的发生发展中起到重要作用。有研究显示VEGF可以将EGFR的刺激导入细胞内，导致细胞持续增殖，最终形成肿瘤［9］。本实验研究发现在低分化的非小细胞肺癌肿瘤组织中VEGF与EGFR的表达均明显升高，在中分化和高分化中两者的表达均相对较低，这种一致的表达水平表明两者在非小细胞肺癌的表达中存在正相关性，两者可能在非小细胞肺癌的发生发展过程中存在协同作用，通过这种协同作用，进一步扩大两者对细胞增殖长生的影响，从而更加促进了肿瘤的发展。这实验同时研究了D2－40和Ki－67在非小细胞肺癌内的表达，发现他们的表达水平均与EGFR的表达一致，即在低分化肿瘤中表达高，在中、高分化肿瘤中表达较低，也存在正相关性，这表明他们可能也与EGFR在非小细胞肺癌的发生和发展过程中起到了协同作用，但这种协同作用的机制有待进一步研究。

人的非小细胞肺癌的发生是一个多因素参与的复杂过程，其中EGFR、VEGF、D2－40、Ki－67的表达起着重要作用，它们都与肿瘤的发生有着密不可分的关系，并且它们的表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关。同时本研究发现，EGFR与VEGF、D2－40、Ki－67的表达具有相关性，表明这三者在肿瘤的发生过程中具有彼此协同的作用。这四个指标可以作为临床检测非小细胞肺癌的重要标志物，可以结合临床参数，指导治疗，评价预后。同时控制这四种指标在肿瘤中的表达，也可以作为非小细胞肺癌临床治疗的新思路。

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2013－12－09）

1007－4287（2014）12－1926－03

吉林市科技局科技计划项目（201133146）