电针治疗对帕金森病大鼠认知功能的保护作用

2014-05-08韩露谢元鸿陈晨肖佳佳吴瑢沈博王晓平

中国神经免疫学和神经病学杂志 2014年5期

韩露谢元鸿陈晨肖佳佳吴瑢沈博王晓平

韩露谢元鸿陈晨肖佳佳吴瑢沈博王晓平

目的研究电针治疗对帕金森病(Parkinson disease,PD)大鼠认知功能的影响。方法通过立体定位向大鼠脑部注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)制备PD大鼠模型,筛选造模成功的大鼠进行为期两周的电针治疗与多巴丝肼药物治疗,Y迷宫评价大鼠的认知能力,通过分子生物学方法测算大鼠造模时受累的右侧半脑组织匀浆中乙酰胆碱转移酶(Ch AT)的酶活性变化,免疫组化观察大鼠右侧半脑脑部海马区及纹状体部Ch AT阳性纤维表达情况。结果与PD模型组大鼠相比,经电针灸治疗的大鼠学习记忆能力明显改善(＜0.05),脑部Ch AT酶活性提高(＜0.01),光镜下可见海马区及纹状体区的Ch AT阳性表达细胞数显著增加(＜0.01)；电针灸治疗与多巴丝肼治疗组相比,大鼠的学习记忆能力及脑部Ch AT表达无统计学差异(＞0.05)。结论电针灸治疗能明显改善PD大鼠认知功能,其机制可能与保护中枢乙酰胆碱神经元及提高Ch AT表达有关。

电针灸；帕金森病；认知功能；Y迷宫；乙酰胆碱转移酶

帕金森病(Parkinson disease,PD)是临床上常见的慢性神经系统退行性疾病,临床表现为运动迟缓、静止性震颤、肌僵直及姿势障碍等［1］。除上述运动症状外,认知功能减退亦是PD患者常见症状之一,国内外临床报道其发生率约为17%～59.5%［2-4］,严重影响患者及患者家庭生活质量。左旋多巴为目前PD治疗的金标准。但长期使用左旋多巴时,约75%的患者在度过药物“蜜月期”后会出现异动症、症状波动等运动并发症［5］。如何改良PD患者的治疗方案,拓宽除传统药物治疗外的替代治疗路径,使不同病程时期的患者能得到有效治疗,成为目前PD研究的焦点。大脑深部电刺激(DBS)作为一种替代治疗手段应用于PD,先后被美国和中国医学界所接受。近期亦有太极拳对PD具有肯定治疗作用的研究发表［6］。

针灸治疗是目前一种治疗PD有效且安全的替代治疗方式［7］,其可有效改善患者的运动症状。随着针灸治疗PD的推广,其对认知功能的作用成为目前关注和探索的焦点。本研究通过对比电针和喂药治疗PD大鼠模型认知功能的变化,旨在探讨电针灸对大鼠认知功能的作用及机制,为临床实践提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物选用健康雄性SD大鼠26只,体质量260～350 g,由上海市第一人民医院实验中心提供。大鼠在标准环境饲养,自由取食饮水,人工昼夜节律(12 h/12 h),经行为学测试无旋转行为。将大鼠随机分为空白对照组(=4)和实验组(= 22)。实验组大鼠进行PD造模。

1.2 主要试剂及器材包括6-羟基多巴胺(6-OHDA,Sigma公司)、盐酸阿扑吗啡(Sigma公司)、乙酰胆碱转移酶(Ch AT)测试盒(南京建成公司)、兔乙酰胆碱转移酶多克隆抗体(Abcam公司)、SABC免疫组化试剂盒(Solarbio公司)、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(天根生化公司)、大鼠脑立体定位仪(BAS公司)、颅骨钻(BAS公司)、紫外/可见光分光光度计(Bio-Rad公司)、组织研磨器(Bio-spec公司)。

1.3 方法

1.3.1 PD造模：将10 mg 6-OHDA溶于2.5 m L含0.2%(质量浓度)抗坏血酸的生理盐水中(终浓度为4μg/μL),4℃冰箱避光冻存。腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠后,将大鼠俯卧固定于立体定位仪上,根据Paxinos&Watson第3版大鼠脑立体定位图谱确定右侧内侧前脑束(MFB)两点,坐标为：前囟后2.8 mm,中线外侧1.95 mm,前囟腹侧8.45 mm；前囟后2.8 mm,中线外侧1.95 mm,前囟腹侧9.00 mm。颅骨钻钻开颅骨,暴露硬膜,通过微量注射器分别向每个靶点注射4 μL 6-OHDA,注射速度0.5μL/min,注射后留针5 min,医用明胶海绵填充颅骨孔后缝合头皮。常规喂养大鼠,造模后每只大鼠腹腔注射20万U青霉素预防感染。于造模后第7、14、28、35天,给予大鼠腹腔注射盐酸阿扑吗啡(0.5 mg/kg)诱导旋转行为,成功模型于注射后5 min内出现旋转行为,向健侧身体环曲,首尾相接连续旋转,观察记录10 min,选择旋转大于等于7圈/min大鼠为PD造模成功大鼠。共16只造模成功。随机选择造模成功大鼠12只,将PD模型大鼠随机分为模型组、电针灸治疗组、多巴丝肼治疗组,各亚组4只。

1.3.2 治疗方法：电针灸治疗组选取大椎穴与百会穴为治疗位点［8］,行针灸治疗,针柄接电针治疗仪,接通连续波,频率100 Hz,强度以大鼠头部抖动为度,持续刺激20 min,每天1次,连续治疗2周。多巴丝肼组每天给予多巴丝肼15 mg灌胃,与电针灸组同时开始治疗,为期2周。空白对照组及模型组每天给予相同体积生理盐水灌胃,常规取食饮水。

1.3.3 学习记忆能力测试：Y迷宫为三臂迷宫,三支臂间互成120°,迷宫底座为金属栅,可通电刺激大鼠。每条支臂顶端各有一小灯泡,接通电源后灯亮的支臂底座无电流通过,作为安全区,其余支臂无光亮,底座通电。治疗结束后,所有大鼠进行Y迷宫行为学测试。实验开始时,将大鼠放于Y迷宫中适应5 min,正式开始后,接通电源,调整电流强度至大鼠在电击作用下出现反应,安全区以无规则次序变换。大鼠每次到达安全区后,灯光延迟10 s后熄灭,熄灭后记作一次测试结束。大鼠所在支臂作为下一次测试起点,随机设定安全区,两次测试间时间间隔30 s。重复上述过程,以大鼠在足底通电后从起步区直接逃至安全区为正确反应,测试至连续10次中有9次正确为学会标准。每只大鼠每天在固定时间测试,每天测试20次,记录每只大鼠达到学会标准前所需的训练次数及反应时间,训练次数的多少和反应时间的长短作为衡量大鼠学习能力的指标。每只大鼠完成当天测试后,及时清洁Y迷宫。学习能力测试结束后,24 h后再用同样方法测试大鼠,仍以连续10次中至少9次反应正确为标准,记录达到标准前的次数和反应时间,对比分析大鼠记忆力情况。

1.3.4 大鼠脑部Ch AT活性分析：学习记忆能力测试结束后,从各组中分别随机取2只大鼠,置冰面上断头取右侧半脑,用4℃预冷的生理盐水冲洗除血,滤纸吸干后称取脑重量,加9倍体积的冰冷生理盐水用组织匀浆器制备10%组织匀浆,按照Ch AT活性测试盒步骤添加反应试剂,以4000 r/ min离心10 min后取上清液显色,在324 nm处测定各管吸光度值,按照试剂盒说明书计算大鼠脑组织中Ch AT活性。

1.3.5 Ch AT免疫组化染色：将各组其余2只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉,暴露心脏,向心室内注射0.5 m L肝素钠抗凝,通过左心室向主动脉插管,固定后剪开右心房,持续以生理盐水冲洗,冲洗结束后灌注预热的4%(质量浓度)多聚甲醛,持续灌注约1 h,随后断头取脑,置于4%(质量浓度)多聚甲醛中固定,梯度酒精脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋。冠状切片(片厚4μm),经融蜡脱蜡处理后,浸泡入柠檬酸缓冲液抗原修复,滴入5%(质量浓度) BSA封闭,滴加一抗并于4℃过夜。第2天取出,经PBS冲洗后加DAB显色,苏木素复染,酒精梯度脱水及透明,最后用中性树脂封片。染色结束后,低倍镜下(×50)观察大鼠右侧半脑海马区及纹状体区Ch AT纤维阳性表达情况,高倍镜视野下(×300)各选择海马区及纹状体区任意3个视野计数Ch AT纤维阳性细胞数目取均值,分别计为每只大鼠右侧半脑海马区及纹状体区Ch AT纤维阳性细胞数。

1.4 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件,计量数据用

± 表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法分析。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆能力比较各组大鼠间学习次数、学习总时间和记忆次数比较差异有统计学意义(均＜0.05),记忆总时间各组间比较无统计学差异(=0.069)。进一步行两两比较：(1)学习能力：与空白对照组相比,模型组学习次数及学习总时间增加(＜0.05)；与模型组比较,电针灸治疗组和多巴丝肼治疗组学习次数和学习总时间均减少(＜0.05)；电针灸治疗组和多巴丝肼治疗组间学习次数和学习总时间比较均无统计学差异(＞0.05)。(2)记忆能力：各组间两两比较无统计学差异(表1)。

表1 各组大鼠Y迷宫学习记忆能力测试结果 (±)

注：与空白对照组比较,*＜0.05；与模型组比较,△＜0.05

组别学习次数(次) 学习总时间(s) 记忆次数(次) 记忆总时间(s)空白对照组 4 39.00±14.98 465.00±322.03 21.00±10.86 96.00±58.36模型组 4 64.67±9.57* 1034.25±82.01* 36.00±1.41 169.50±40.31电针灸治疗组 4 23.75±8.85△ 251.50±118.18△ 6.75±5.19 53.25±28.33多巴丝肼治疗组 4 33.50±8.35△ 289.75±151.07△ 13.75±7.23 77.50±41.40值10.521 14.208 7.012 3.231值0.001 0.000 0.008 0.069

2.2 各组脑组织Ch AT酶活性空白对照组、模型组、电针灸治疗组和多巴丝肼治疗组Ch AT活性分别为(13.45±2.60)、(2.72±3.36)、(18.02± 7.55)、(18.24±4.65)IU,各组间比较差异有统计学意义(=8.899,=0.002),模型组Ch AT活力低于空白对照组(＜0.01),电针灸治疗组和多巴丝肼治疗组Ch AT活力较模型组均增强(＜0.01),电针灸治疗组与多巴丝肼治疗间Ch AT活性比较差异无统计学意义(=0.95)。

2.3 各组ChAT纤维阳性细胞数 (1)低倍镜下观察：模型组右脑海马及纹状体神经元减少,排列稀疏,细胞胞质较其余组减少；经过多巴丝肼及电针灸刺激治疗后,大鼠脑部Ch AT表达阳性细胞数量增加,形态完整,排列紧密,其中电针灸治疗后可见Ch AT表达阳性细胞数量明显增加(图1)。(2)高倍镜下观察：模型组海马区和纹状体区Ch AT阳性细胞数较空白对照组减少(＜0.01)；而电针灸治疗组和多巴丝肼治疗组Ch AT阳性细胞数均较模型组增加(＜0.01),而电针灸治疗组和多巴丝肼治疗组间比较差异无统计学意义(均＞0.01)(表2)。

表2 各组大鼠海马区、纹状体区Ch AT纤维阳性表达数 (±)

注：与空白对照组比较,*＜0.01；与模型组比较,△＜0.01

组别海马区纹状体区空白对照组 45.50±5.94 43.17±8.76模型组 18.67±6.54* 24.00±3.02*电针灸治疗组 42.67±9.57△ 35.25±7.22△多巴丝肼治疗组 40.25±6.82△ 41.16±5.62△值30.333 20.975值0.000 0.000

3 讨论

图1 低倍镜下观察各组大鼠海马区Ch AT纤维阳性细胞表达(DAB染色,×50)

认知功能包括学习、记忆、空间辨识、注意和探索等能力,与人类的正常工作生活息息相关。PD患者认知功能下降主要表现为空间辨识能力、探索能力、学习记忆和执行能力下降,信息提取障碍等［9］。中枢胆碱能系统是构成学习、记忆等认知功能的主要系统通路,其存在于脑内诸多部位及核团。基底前脑发出大量胆碱能纤维,在中枢神经系统投射广泛,可延伸至皮层、海马、纹状体、杏仁核及丘脑等。实验证明,认知能力的下降与这些部位的Ch AT活性降低、胆碱能神经元缺失相关,使大鼠的中枢胆碱能系统受损,引起空间记忆能力下降［10］。目前认为,PD患者认知障碍的发生,与患者额叶皮质、海马区及基底节区的广泛脑部组织萎缩及破坏,引起脑部乙酰胆碱、多巴胺及5-羟色胺等神经递质的改变密切相关［11］。

中医学认为PD属于“震颤”、“内风”等疾患范畴。临床上中医将PD分为痰热风动、气滞血瘀、气血不足、肝肾阴虚4型。目前临床上治疗PD常用针刺位点有百会穴、大椎穴、合谷穴等。根据大鼠穴位图谱,大鼠百会穴及大椎穴易于定位,针刺效果良好,故本实验选取两位点,予以电针灸治疗。

Y迷宫利用大鼠对光亮及空间的辨识,测定大鼠空间定向、反应时间、记忆再现等能力,作为评价大鼠认知功能的指标,与临床上PD患者所出现的认知功能障碍性质相近。通过测定疾病造模时受累的右侧半脑Ch AT酶活性和免疫组化测定纹状体海马区Ch AT纤维阳性表达数可探究脑部Ch AT表达及表达程度。本研究结果显示,模型组PD大鼠出现明显的认知能力下降,光镜下观察可见海马区、纹状体区的Ch AT阳性细胞表达显著减少,脑组织匀浆检测中枢Ch AT酶活性降低。经过电针灸及多巴丝肼治疗后,PD大鼠的认知能力均有明显改善,表现为Y迷宫中学习次数及学习总时间的减少,同时光镜下Ch AT阳性表达数增加,受累脑部Ch AT酶活性升高。对比电针灸治疗组与多巴丝肼治疗组,大鼠的认知能力、脑部Ch AT表达及表达程度均无统计学差异,提示电针灸与传统药物治疗对PD的认知改善作用可能相近。

该研究结果显示,模型组和空白对照组大鼠的记忆能力比较无统计学差异,其原因可能为：(1)该研究采用的判定记忆行为的标准较高,可能导致一些记忆行为被误判。(2)大鼠造模后认知能力受损,可能需要更长的时间更多的学习次数形成记忆。(3)由于认知能力损伤模型的特殊性,记忆能力受损可能需要更长时间才能明显表现。其确切原因需要进一步完善研究证实。本实验中进行Y迷宫测验大鼠样本量较小,每组仅4只,其确切结论有待进一步增加样本量验证。另外,本实验统一选择大鼠造模时受累的右侧半脑进行研究,在未来的实验研究中还可进一步拓展至双侧半脑之间的相互比较等,以获得更为全面的数据和结论。

临床上,中晚期PD患者往往运动症状严重,认知功能受损明显［12-13］,而长期运用传统药物治疗,亦会伴发运动并发症。综上所述,在中晚期PD患者中恰当地运用电针灸治疗,部分替代左旋多巴药物,可能会减少患者运动并发症,改善患者的认知能力,进而更大程度地提高患者的生活质量。

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(本文编辑：时秋宽)

本刊关于投稿中表格制作的几点要求

在科技论文中目前普遍倡导和推荐使用“三线表”。表格是完整的、可独立存在的形象化语言,表格的内容应简洁直观,以数字表达为主,避免与文字表述过于重复,同时表格应具有自明性。

1三线表格的组成(1)表序和表题：表序即表格的序号,一篇论文中如只有1个表格,则表序编为表1,有两个及以上的表格,应按先后顺序标出表的序号。序号用阿拉伯数字表示；表的序号和标题置于表的上方。表题应准确得体、简短精练,中间不用标点,末尾不加句号。(2)表头：指表格顶线与栏目线之间的部分,栏目是该栏的名称,反映了表身中该栏信息的特征或属性。(3)表身：三线表内底线以上,栏目线以下的部分叫做表身,是表格的主体,表身内的数字一般不带单位,百分数也不带百分号,均归并在栏目中,表身中不应有空项,如确系无数字的栏,应区别情况对待,在表注中简要说明,不能轻易写“0”或画“-”线等填空,因“0”代表实测结果为零,“-”可代表阴性反应。(4)表注：必要时,应将表中的符号、标记、代码,以及需要说明的事项,以最简练的文字,横排于表身下。

2表格制作的要求(1)主谓清楚：表的横标目为主语,指表中所要说明的对象；纵标目为谓语,表示对主语的说明,读表的顺序为：主语→谓语→数据。特殊情况时,主、谓语可以换位,但换位后的主谓语的性质不变。作者在设计表格时,应力求科学、准确、一目了然。一个好的表格应具有语言学上的逻辑性,即主谓清楚、层次分明、标目合理。(2)数字准确：表格内的数字应准确无误,一律用阿拉伯数字,上下个位数对齐,数字中如有“±”或“～”号,则以其为中心对齐。表内不宜用“同上”、“同左”、“″”同类似词,一律填入具体的数字或文字。未取得数据者以“″”表示；未做者则以“-”表示。表内有效数字应一致。(3)表格内的单位：表格内的单位有共用单位和特有单位,共用单位可直接写在表题后并加圆括号,特有单位可写在相应标目后并加圆括号,且表内单位应与正文一致。(4)表格中的统计符号：论文中的显著性检验,只在表下注释值是不够的,应将检验方法、计算结果及值均列出,以便读者进一步了解实际差异的大小。

WANG Xiao-ping,Email：x_p_wang@sjtu.edu.cn

Objective To study the cognitive-improving effect of electrical acupuncture treatment on Parkinson’s disease(PD)-model rats.Methods The PD model was established by direct injection of 6-hydroxydopamine(6-OHDA)into the medial forebrain bundle using stereotactic technique.The successful PD models were treated with a two-week electrical acupuncture or Levodopa and Benserazide therapy,respectively. The choline acetyl transferase(Ch AT)level in the right halves of the brain of the 6-OHDA-induced PD models treated with acupuncture or drugs were examined by tissue homogenization and immunohistochemical test(IHC), and the cognitive function were assessed by Y-maze test.Results Compared with the PD model group,the study ability of the electrical acupuncture treatment group was improved(＜0.05),the brain Ch AT activity was higher(＜0.01),and the Ch AT-positive cell number in the hippocampus and striatum was increased(＜0.01).And there was no significant difference in study ability between acupuncture treatment and drug treatment (＞0.05).Conclusions Electrical acupuncture treatment improved cognitive function of PD models due to its potential protective role on acetylcholine neurons and up-regulating effect on brain Ch AT level.

electrical acupuncture；Parkinson’s disease；cognitive function；Y-maze；choline acetyl transferase

R742

：A

：1006-2963(2014)05-0323-05