亚氨基二丙腈构建的抽动障碍大鼠脑组织IL-6及TNF-α变化及意义

2014-05-08刘艳艳陈燕惠

中国神经免疫学和神经病学杂志 2014年5期

刘艳艳陈燕惠

刘艳艳陈燕惠

目的观察亚氨基二丙腈(iminodipropionitrile,IDPN)构建的抽动障碍(tic disorder,TD)模型大鼠脑组织白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平变化,探讨免疫功能紊乱在TD发生中的作用。方法出生21日龄(P21)SD大鼠随机分为健康对照组(对照组)、TD组和TD +药物干预组(干预组),每组8只。TD组和干预组采用腹腔注射IDPN构建TD大鼠模型。干预组于建模第8天开始予以氟哌啶醇按体质量0.5 mg/(kg·d)灌胃,TD组及对照组予以等体积生理盐水灌胃,1次/d,持续7 d。对TD组和干预组进行抽动行为评分,采用ELISA法检测各组大鼠脑组织IL-6及TNF-α的水平,通过计算胸腺指数、脾脏指数评定各组大鼠免疫功能。采用直线相关分析法分析大鼠抽动行为评分与IL-6、TNF-α水平及胸腺指数、脾脏指数的相关关系。结果 TD组大鼠脑组织中IL-6、TNF-α水平分别为(2081.63±528.26) ng/L、(146.53±5.66)ng/L,均较对照组﹝(879.13±318.42)ng/L、(120.83±2.15)ng/L﹞明显升高(＜0.05),胸腺指数和脾脏指数分别为0.27±0.01、0.33±0.02,均较对照组(分别为0.38±0.25、0.42±0.08)明显降低(＜0.05)；干预组大鼠脑组织中IL-6、TNF-α水平﹝(921.00±60.00)ng/L、(129.42±10.77)ng/L﹞及胸腺指数(0.34±0.04)和脾脏指数(0.43±0.06)与对照组比较差异无统计学意义(＞0.05),与TD组比较,干预组大鼠脑组织中IL-6、TNF-α水平明显降低(＜0.05),胸腺指数、脾脏指数明显升高(＜0.05)。相关分析显示,大鼠抽动行为评分与IL-6和TNF-α水平呈正相关(=0.529,0.764；＜0.05),与胸腺指数、脾脏指数呈负相关(=-0.710,-0.473,＜0.05)。结论大鼠抽动行为与大鼠脑组织中细胞因子IL-6、TNF-α水平及胸腺指数、脾脏指数相关,细胞因子IL-6、TNF-α可能介导TD的发生。

抽动障碍；亚氨基二丙腈；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子-α；免疫功能

抽动障碍(tic disorder,TD)是一种发病于儿童和青少年时期的慢性神经精神疾病［1］,以多发性运动抽动和发声抽动为特征,近年来其发病率有明显增高趋势［2］。基底节纹状体多巴胺(dopamine, DA)活动过度或DA受体超敏感被认为是其发生的重要机制,DA系统功能紊乱的原因至今尚不清楚。近年来一些研究发现TD患者存在免疫功能紊乱［3］。在神经免疫网络中细胞因子与多种神经系统疾病的发生密切相关。为进一步了解免疫功能紊乱在TD中的重要作用,本研究采用亚氨基二丙腈(iminodipropionitrile,IDPN)构建TD动物模型［4］,通过研究大鼠脑组织白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平变化,探讨免疫功能紊乱在TD发生中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂及药品出生后21日龄(P21)SD雄性大鼠(上海史莱克实验动物中心提供,清洁级,体质量60～70 g),置于恒温恒湿环境分笼饲养,自由摄食和饮水。IDPN(美国Sigma公司)；大鼠IL-6、TNF-αELISA试剂盒(武汉博士德公司)；氟哌啶醇(上海信谊九福药业有限公司,批号050301)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型建立：大鼠随机分为健康对照组(对照组)、TD组和TD+药物干预组(干预组),每组8只。对TD组和干预组采用Diamond等［4］的神经毒素全身用药法建立TD模型,即将IDPN溶于生理盐水,按给药剂量150 mg/(kg· d)、体积1 m L/kg的方法腹腔注射,1次/d,连用7 d。建模后大鼠出现头部抽动、口腔运动、舔食前爪等行为,其中头部抽动的刻板行为明显、易分辨,且抽动频率高,作为该模型成功标准。本实验建模均成功,Diamond等［4］抽动行为评分均≥2分。

1.2.2 药物干预：干预组大鼠于建模后第8天(即P28)始按体质量0.5 mg/kg灌服氟哌啶醇,氟哌啶醇用生理盐水稀释至0.1 mg/m L,对照组和TD组予等体积生理盐水灌胃,1次/d,连续7 d。

1.2.3 抽动行为评分：采用Diamond等［4］的方法对TD组和干预组进行抽动行为评分,3次/d,每次计时5 min,分别于8：00AM,2：00PM,8：00PM进行,各次累加的和计为总评分。评分标准：0分为无刻板运动,与生理盐水的作用无差别；1分为有旋转行为；2分为垂直的头部和颈部的运动障碍(上下运动过多)；3分为垂直的头部和颈部的运动障碍加旋转行为；4分为头向侧摆并伴有头颈部上下运动过多。

1.2.4 脑组织病理观察：药物干预第7天各组大鼠(即P34)在冰上快速断头取脑,取右侧脑组织置于40 g/L的多聚甲醛中固定,常规石蜡包埋,4 μm厚切片。切片经二甲苯脱蜡,各级乙醇至水洗(100%乙醇2 min→95%的乙醇1 min→80%乙醇1 min→70%乙醇1 min→蒸馏水洗2 min),苏木素-伊红(HE)染色后洗去多余染料,常规脱水透明封片,于400倍光镜下观察纹状体形态结构。

1.2.5 胸腺指数、脾脏指数测定：药物干预第7天各组大鼠(P34)断头处死,快速打开胸腹腔,取出胸腺和脾脏,用生理盐水冲洗干净后,滤纸吸干,用电子天平称取其体质量,根据如下公式分别计算胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数(脾脏指数)=100 ×胸腺质量(脾脏质量)/体质量(单位均为g)。胸腺指数和脾脏指数大者表明机体免疫水平高。

1.2.6 脑组织IL-6、TNF-α水平测定：药物干预第7天各组大鼠(P34)在冰上快速断头取脑,取左侧脑组织匀浆(4℃),采用ELISA法检测大鼠脑组织中IL-6、TNF-α水平。

1.2.7 相关性分析：采用直线相关分析法分析大鼠抽动行为评分与IL-6、TNF-α水平及胸腺指数、脾脏指数的相关关系。

1.3 统计学处理应用SPSS 15.0软件进行分析。数据用均数±标准差表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验；TD组与干预组间大鼠抽动行为评分比较采用检验；相关分析采用直线相关分析法。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑组织纹状体HE染色结果 TD组和干预组大鼠纹状体结构清晰,布局有序,细胞形态正常,神经元无损伤缺失,胞体、胞核清晰,核仁清楚,与对照组大鼠无明显差异(图1)。

2.2 脑组织IL-6、TNF-水平脑组织中IL-6、TNF-α水平三组间比较差异有统计学意义。TD组脑组织IL-6、TNF-α水平高于对照组和干预组(＜0.05),而干预组其水平与对照组比较差异无统计学意义(＞0.05)(表1)。

2.3 各组胸腺指数和脾脏指数比较胸腺指数和脾脏指数三组间比较差异有统计学意义。TD组大鼠胸腺指数和脾脏指数明显低于对照组和干预组(＜0.05),干预组大鼠胸腺指数和脾脏指数与正常对照组比较无统计学差异(＞0.05)(表1)。

2.4 行为学评分结果干预组大鼠抽动行为评分(2.12±0.35)较TD组大鼠(3.00±0.53)明显降低(=3.255,＜0.05)。

2.5 相关性分析大鼠抽动行为评分与IL-6、TNF-α水平成正相关0.05)；与胸腺指数、脾脏指数成负相关(= -0.710,=-0.473,＜0.05)。

3 讨论

TD好发于儿童和青少年时期,神经细胞DA活动过度或DA受体超敏感是目前最为公认的导致TD的重要机制之一。P28大鼠的发育水平相当于人类青少年时期。IDPN可选择性破坏锥体外系的DA系统,保持DA浓度持久降低,使动物在生长发育过程中出现DA受体超敏现象,导致动物出现刻板行为。IDPN所致TD模型制作方法简单、易用,抽动行为可一直稳定保持3个月,随着年龄的增长抽动行为可逐渐减弱或消失,且该模型脑组织切片光镜下无改变,与儿童特发TD的病理生理改变类似,被公认为是研究TD比较理想的动物模型［5］。本研究参照Diamond［4］等的方法成功诱导出大鼠的头部抽动、肩部抽动等类似抽动症的行为表现,HE染色结果显示TD大鼠纹状体无明显异常改变,验证了上述IDPN造成的TD模型脑组织切片光镜下无病理改变的特点。

图1 各组大鼠脑组织纹状体表现(HE×400)

表1 各组大鼠脑组织IL-6、TNF-α水平及胸腺指数、脾脏指数比较 (=8,±)

近年来不少研究提示感染与TD的发生和迁延不愈密切相关。有报道称A族β-溶血性链球菌感染后的自身免疫反应与抽动症密切相关［6］。陈江鱼等［7］的研究结果提示TD患儿EB病毒、人巨细胞病毒、肺炎支原体DNA检出率显著高于健康对照组。进一步研究显示,虽然TD患儿感染发生率较高,但从临床表现、实验室检查以及中枢神经系统影像学检查均未找到感染引起中枢神经系统损伤,导致TD发生的相关证据。不少学者推测TD并非感染因素直接损伤所致,而是由于病原微生物在感染机体后,介导了自身免疫功能紊乱,引起神经递质失调,从而导致TD发生,但这一假说尚未得到实验数据证实。本实验通过动物研究以期探讨免疫功能紊乱在TD发病机制中的作用。

本研究通过对脑组织IL-6、TNF-α检测,发现TD组大鼠脑组织中IL-6、TNF-α水平明显高于对照组；氟哌啶醇干预后大鼠脑组织中IL-6、TNF-α水平较TD组明显下降,与对照组比较无明显差异,同时抽动症状明显改善。

细胞因子中IL-6、TNF-α互相渗透、互相协调,在炎性反应和免疫应答中起重要作用,且具有广泛生物学活性。研究表明,IL-6可通过激活Janus酪氨酸激酶(JAK)/信号转导和转录活化蛋白(STAT3)途径影响儿茶酚胺类神经递质酪氨酸羟化酶的表达,进而影响儿茶酚胺类神经递质的合成代谢［8］,引起DA受体的超敏感。TNF-α可以增加α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体在突触表面的表达而增加突触传递的效率［9］,AMPA受体的激活,可显著改变神经元活动,包括DA释放。另外,有报道称DA亦可通过作用D3受体影响调节性T细胞功能的发挥［10］,导致免疫紊乱。

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官,它们能在一定程度上反映机体免疫功能的状况。胸腺指数和脾脏指数的大小直接反映机体免疫水平的高低。本研究中TD组大鼠的胸腺指数和脾脏指数较对照组明显偏低,表明其可能存在免疫功能紊乱；药物干预后大鼠胸腺指数和脾脏指数明显增高,与对照组比较无明显差异,大鼠抽动行为评分与脑组织中IL-6、TNF-α水平成正相关,与胸腺指数、脾脏指数成负相关,提示IL-6、TNF-α、胸腺指数及脾脏指数异常均与大鼠抽动行为密切相关。脑组织中IL-6,TNF-α水平越高,抽动症状越为明显,推测细胞因子IL-6、TNF-α可能与TD的发生有关,免疫紊乱可能在TD发病机制中起重要作用。

本研究显示TD大鼠存在免疫功能紊乱,其细胞因子IL-6、TNF-α可能在TD发生中起重要作用,深入了解TD发生与细胞因子的关系有待于扩大细胞因子的检测范围。至于免疫功能紊乱通过何种机制介导神经系统特别是多巴胺系统功能变化进而导致TD以及免疫制剂能否应用于TD治疗,仍需进一步研究。

［1］李念,朱翠珍,黄颐.遗传因素和环境因素在抽动障碍病因学中的作用［J］.中华精神科杂志,2010,43(4)：246-249.

［2］田广燕,梁向荣,高在芬,等.抽动障碍患儿432例血铅水平对脑电图活动的影响［J］.实用儿科临床杂志,2011,26(24)：1860-1861.

［3］Cath DC,Hedderly T,Ludolph AG,et al.European clinical guidelines for Tourette syndrome and other tic disorders.Part I：Assessment［J］.Eur Child Adolesc Psychiatry,2011,20(4)：155-171.

［4］Diamond BI,Reyes MG,Borison R.A new animal model for Tourette syndrome［J］.Adv Neurol,1982,35(2)：221-225.

［5］刘智胜.小儿多发性抽动症［M］.北京：人民卫生出版社, 2002.238-239.

［6］Lin H,Williams KA,Katsovich L,et a1.Streptococcal upper respiratory tract infections and psychosocial stress predict future tic and obsessive-compulsive symptom severity in children and adolescents with tourette syndrome ad obsessive-compulsive disorder［J］.Biol Psychiatry,2010,67(7)：684-691.

［7］陈江鱼,赵宏伊,李杰,等.儿童抽动障碍与病原微生物感染及其免疫的相关性［J］.实用儿科临床杂志,2012,27(19)：1536-1537.

［8］李荣,王杰军,沈毅珺,等.IL-6体外对PC12细胞株DA和NE代谢抑制的机制［J］.世界华人消化杂志,2008,16(1)：45-49.

［9］成祥林,张晓琴.肿瘤坏死因子-α与癫痫［J］.国外医学神经病学神经外科学分册.2003,30(3)：278-279.

［10］余庆皋,杨欢,杨乐,等.抑郁症中Foxp3的变化及其与神经递质的关系［J］.神经疾病与精神卫生,2008,8(5)：341-344.

CHEN Yan-hui,Email：yanhui_0655@126.com

Objective To observe the levels of interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in the tic disorder(TD)rats induced by iminodipropionitrile(IDPN),and to explore the role of immune dysfunction in TD.Methods Twenty-four male SD rats aged 21 days were randomly divided into 3 groups：the normal control group,the TD group and the drug intervention group.There were 8 rats in each group.TD animal model in the TD group and the drug intervention group was established by intraperitoneal injection of IDPN.From the 8th day after the modeling,these rats in the drug intervention group were given haloperidol［0.5 mg/(kg·d)］,while those rats in the TD group and the normal control group received same amount of saline,once a day,consecutively for 7 days.The scores of stereotyped behavior of rats in the TD group and the intervention group were evaluated by Diamond’s method.After the behavioral tests,the rats in the three groups were killed,and the brain,thymus and spleen were examined.The levels of IL-6 and TNF-αin the brains were measured by ELISA.Also,thymus index and spleen index were used to evaluate the immune function of rats.The relationship between stereotyped behavior scores of rats and the concentrations of IL-6 and TNF-α,the thymus index,the spleen index were assessed by linear correlation analysis.Results The concentrations of IL-6 and TNF-αin the brains in the TD group［(2081.63±528.26)ng/L,(146.53±5.66)ng/ L］were significantly increased in comparison with those in the normal control group［(879.13±318.42)ng/L,(120.83±2.15)ng/L］(＜0.05),while the thymus index(0.27±0.01)and spleen index(0.33±0.02)of rats were significantly decreased in comparison with those in the normal control group［(0.38±0.25),(0.42± 0.08)］(＜0.05).There were no significant differences in the concentrations of IL-6,TNF-αand the thymus index,spleen index between the drug intervention group［(921.00±60.00)ng/L,(129.42±10.77)ng/L, (0.34±0.04),(0.43±0.06)］and the normal control group(＞0.05).Compared with those in the TD group,the concentrations of IL-6 and TNF-αin the brains in the intervention group were significantly decreased (＜0.05),while the thymus index and spleen index of rats in the intervention group were significantly increased (＜0.05).It showed that the behavior scores were positively correlated to the concentrations of IL-6 and TNF-α(=0.529,0.764；＜0.05),while inversely correlated to the thymus index and the spleen index(= -0.710,-0.473；＜0.05).Conclusions The behavior of TD rats is highly correlated to the changes in IL-6,TNF-αof the brain tissue,thymus index and spleen index.It suggests that IL-6 and TNF-αmay mediate the occurrence of TD.

tic disorder；iminodipropionitrile；interleukin-6；tumor necrosis factor-α；immune function

R729

：A

：1006-2963(2014)05-0340-04