速灭威荧光分子印迹聚合物研究

虞杨，刘冬蕊，汪羽，方国臻，王硕

（食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

速灭威（Metolcarb，3-甲苯基-N-甲基氨基甲酸酯）是氨基甲酸酯类杀虫剂的主要品种之一，广泛使用在稻田、蔬菜、水果等农作物的害虫防治[1]。分子式为C9H11NO2，结构式如图1所示。

图1 速灭威的分子结构Fig.1 Chemical structure of carbamate

人们食用残留速灭威农药的蔬果后，农药就会在人体内积蓄甚至造成人体急性或慢性中毒。为了避免速灭威农药残留给人类带来的危害，发展快速、可靠、灵敏的食品中速灭威残留分析方法具有重要的现实意义。

分子印迹技术是由著名的诺贝尔奖获得者Pauling[2]提出的。它是将模板分子与功能单体通过共价键或非共价键作用形成配合物，加入交联剂、引发剂，聚合形成一个高度交联的刚性分子。洗脱去除模板分子后，分子印迹聚合物的网络结构中留下了在空间大小、结合位点与模板分子互补的三维立体孔穴，表现出对印迹模板分子高度的选择性识别能力[3-8]。

目前，分子印迹技术主要应用于固相萃取、色谱分离和免疫分析。由于传感器检测技术具备分析速度快、成本低，可在线检测等特点，优于传统的检测方法，因此将分子印迹聚合物当做敏感材料用于制备传感器（分子印迹聚合物传感器）成为食品安全检测领域重要的发展方向。本实验通过合成一种荧光功能单体，制备出具有选择识别性能的荧光分子印迹聚合物，旨在为食品中农药残留检测提供一种新的手段。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

速灭威、残杀威、异丙威、仲丁威、2-氨基吡啶、乙二醇二甲基丙烯酸酯：美国Sigma公司；丙烯酰氯：上海aladdin试剂有限公司；甲基丙烯酸、甲醇、甲苯、乙腈：天津市北方天医化学试剂厂；偶氮二异丁腈：天津市科密欧化学试剂开发中心；集热式加热磁力搅拌器（DF-101Z）：郑州长城科工贸有限公司；电热式恒温水浴锅（SY型）：天津欧诺仪器仪表有限公司；超声波清洗器（KQ-500B）：昆山市超声仪器有限公司；台式冷冻离心机（Centrifuge 5804R）：德国 Eppendorf公司；旋转蒸发器（RE-3000）：上海亚荣生化仪器厂；紫外可见分光光度计（Cary50-Bio）：澳大利亚Victoria公司；荧光分光光度计（F-2500）：日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 荧光功能单体的制备

准确称量1.882 g 2-氨基吡啶置于100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL二氯甲烷，室温搅拌10 min，逐滴加入三乙胺2.79 mL后，再缓慢滴加丙烯酰氯1.79 mL，补加20 mL二氯甲烷，室温搅拌反应24 h。旋蒸除去溶剂后加入乙酸乙酯搅拌4 h，过滤，滤渣用乙酸乙酯洗涤两次，合并滤液，用0.22 μm的有机滤膜过滤，旋蒸除去乙酸乙酯溶剂，即制得2-氨基吡啶丙烯酰胺荧光功能单体，低温干燥备用。

1.2.2 速灭威分子印迹聚合物的合成

在25.00 mL的具塞圆底烧瓶中加入33.00 mg速灭威，与0.50 mL乙腈和0.50 mL甲苯磁力搅拌使其完全溶解，然后加入荧光功能单体2-氨基吡啶丙烯酰胺29.60 mg，磁力搅拌反应30 min后，加入辅助功能单体甲基丙烯酸（MAA）34 μL，搅拌反应 4 h，加入交联剂EDMA 752 μL，再加入 20.00 mg引发剂 AIBN，超声氮吹后孵育热聚合。制得的分子印迹聚合物充分研磨、过筛，最后进行索氏提取。非分子印迹聚合物除不加模板分子速灭威外，其余操作步骤与上述过程相同。

1.2.3 荧光分子印迹聚合物对速灭威的平衡结合实验

准确称取10 mg的分子印迹聚合物于1.5 mL安道管中，分别加入 1 mL 不同浓度（0、10、20、30、40、60、80、100 mg/L）的速灭威甲醇溶液，充分震荡。取悬浊液稀释100倍，测定荧光强度。同时平行做非印迹聚合物对速灭威的平衡结合实验。使用荧光分光光度计测定时激发波长设定为300 nm。

1.2.4 吸附动力学实验

准确称取10 mg速灭威分子印迹聚合物于1.5 mL安道管中，加入1 mL 40 mg/L的速灭威甲醇标准溶液，在室温下分别振荡 10、20、30、60、120、180 min，取悬浊液稀释100倍，测定荧光强度。测定条件与平衡结合实验相同。

1.2.5 荧光选择性吸附实验

分别准确称取多份10 mg印迹、非印迹材料于1.5 mL安道管中，分别各加入1 mL的甲醇溶液作空白，1 mL浓度为50 mg/L的速灭威甲醇溶液、1 mL浓度为50 mg/L的残杀威甲醇溶液、1 mL浓度为50 mg/L的异丙威甲醇溶液、1 mL浓度为50 mg/L的仲丁威甲醇溶液，充分震荡，取悬浊液稀释100倍，分别测定各种底物在印迹聚合物和非印迹聚合物上的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

实验选用了乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃为聚合反应的溶剂进行研究，用吸附容量评价聚合物的吸附性能[9]，结果见表 1。

表1 合成聚合物的溶剂的选择Table 1 Various solvent investigated for the preparation of the polymers of Metolcarb

虽然四氢呋喃（THF）的极性很低，比较适合作为反应溶剂，但是对于本实验采用其合成的聚合物吸附效果并没有乙腈的好，并且溶解在四氢呋喃中的荧光功能单体需超声30 min才能较好的溶解；实验中加入甲苯作为致孔剂，以增加聚合物孔径的大小和数量，提高模板分子在聚合物中的传质速度，改善响应时间。从吸附容量的大小可以看出，在模板分子、功能单体和交联剂用量相同的情况下，使用乙腈作为致孔剂的聚合物吸附效果较好，且加入甲苯后明显改善了聚合物的吸附效果和特异性，因此，优化后的溶剂确定为0.5 mL乙腈和0.5 mL甲苯。

2.2 模板分子、功能单体和交联剂的配比

由于甲基丙烯酸（MAA）为实验常用的性能良好的功能单体，并且MAA的羧基能与速灭威上的胺基形成氢键，为进一步改善印迹聚合物的识别性能，本实验中采用了辅助功能单体MAA参与聚合过程。在初步优化的模板分子、荧光功能单体和交联剂比例的基础上，继续优化了各反应物的比例，如表2所示。

表2 模板分子、功能单体和交联剂合成聚合物的配比Table 2 Various ratios of template molecule，fluorescent functional monomer，co-monomer，cross-linker investigated for the preparation of the polymers

由表2可以看出，进一步优化后的印迹聚合物吸附性能得到了明显的提高，这说明加入辅助功能单体MAA后，增加了印迹聚合物中额外的氢键结合位点。过高的交联剂比例对聚合物的识别性和选择性没有改善，同时减小荧光单体和改变MAA的比例会导致聚合物吸附性能变差。本实验最终确定的模板分子、荧光功能单体、辅助功能单体（MAA）和交联剂（EDMA）的摩尔比例为 1∶1∶1∶20，该条件合成的聚合物刚性适中，提高了聚合物的选择性和识别性。

2.3 荧光分子印迹聚合物对速灭威的平衡结合

荧光分子印迹聚合物对速灭威的平衡结合见图2。

图2 印迹聚合物吸附不同浓度速灭威的荧光光谱图Fig.2 The curve of fluorescence intensity after adsorbing different concentration of metolcarb using MIP

由图2可以看出，合成的荧光分子印迹聚合物与不同浓度的速灭威相互作用后，产生了不同的荧光信号变化，随着速灭威浓度的增大，聚合物悬浊液的荧光强度相应的减小。这说明合成的荧光分子印迹聚合物对速灭威有吸附作用，并且在吸附速灭威后，荧光发生了不同程度的猝灭，完成了将吸附浓度的大小转变成相应荧光强度的过程，起到了荧光传感器的作用。同时，非印迹聚合物对不同浓度的速灭威也有一定程度的响应，但是它对速灭威浓度的响应不如印迹聚合物的显著，随目标物浓度的变化其荧光猝灭的程度较小，这说明了非印迹聚合物对模板分子速灭威也有一定程度的吸附，但主要是非特异性吸附，不具备印迹聚合物对目标物有特异性吸附的良好性能。

2.4 荧光分子印迹聚合物对速灭威的吸附动力学

在3 h内不同的时间条件下，研究了印迹聚合物吸附相同浓度的速灭威后荧光强度随时间的变化趋势，见图3。

图3 印迹聚合物的相对荧光强度随时间的变化曲线Fig.3 The curve of relative fluorescence intensity with the change of time using MIP

图3表明，在30 min内印迹聚合物的初始荧光强度I0与吸附速灭威后的荧光强度I比值随时间明显增大，这是因为在不同时间下印迹聚合物吸附速灭威后，荧光发生了不同程度的猝灭。随着时间的增加，聚合物对模板分子的吸附基本完全，猝灭程度也趋于稳定，荧光强度值基本保持不变。由图3可知，印迹聚合物在2 h内已经完成97.7%的吸附，说明吸附速度较快，该聚合物具有较好的传质速度和吸附性能。

2.5 荧光分子印迹聚合物对速灭威的选择性

选择3种与模板分子速灭威结构类似的化合物残杀威、异丙威和仲丁威进行荧光聚合物对不同底物吸附效果研究，实验中分别固定各底物的浓度相同并吸附相同的时间，结果见图4。

图4 聚合物对不同底物的荧光选择性Fig.4 Fluorescent selective adsorption of different substrates for using MIP and NIP

由图4可知印迹聚合物对速灭威的荧光响应最显著，说明荧光猝灭最明显。虽然残杀威、异丙威和仲丁威的荧光强度值也发生了下降，但是不如速灭威下降明显，这可能是因为合成的荧光分子印迹聚合物具有对模板分子速灭威特定识别的孔穴和位点，其他的类似物与速灭威的形状和大小存在差异，因此不能被更好的吸附，也就不能通过荧光信号传导表现为荧光强度值更多的减小；非印迹聚合物中的荧光信号来源于聚合物中的荧光单体，但是与底物发生吸附作用时完全凭借聚合过程中形成的无序空腔，因此表现为非印迹聚合物吸附4种物质后的荧光猝灭程度相差不多。这也进一步说明了合成的荧光印迹聚合物对模板分子速灭威具有较高的选择性和识别性。

3 结论

采用本体聚合的方法，以速灭威为模板分子，2-氨基吡啶丙烯酰胺为荧光功能单体，甲基丙烯酸为辅助功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，合成了对速灭威有吸附作用的荧光分子印迹聚合物。实验表明，溶剂的选择和不同反应物之间的比例组成主要影响聚合物的选择性识别能力。将合成的印迹聚合物作为荧光传感器，对不同浓度的目标物以及吸附不同的时间均有不同的响应；对类似物的响应识别也存在明显差异，这为分子印迹聚合物应用于荧光传感器提供了思路，具有广阔的开发前景。

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