超声波辅助提取明日叶查尔酮的工艺优化

宁鸿珍，陈欣华，王曼曼，王茜，刘楠，马东，王丹丹，高胜海

（河北联合大学公共卫生学院，河北省煤矿卫生与安全实验室，河北唐山063000）

明日叶（Angelica keiskei）又名八丈芹，长寿菜，海峰人参，是伞形科多年生草本植物，原产于日本国伊豆、八丈诸岛[1]。明日叶被誉为“21世纪的健康食品”，富含多种维生素、矿物质等营养成分和查尔酮等生物活性物质[2]，在营养和医疗保健方面有重要功能，作为绿色食品具有广阔的发展前景。查尔酮是植物体内合成黄酮的前提，是一种重要的植物色素，其基本骨架为1，3-二苯基丙烯酮[3]。据报道[4-8]，查尔酮对肿瘤有明显的抑制作用、还有强烈的抗菌作用、同时有抗衰老、抗血栓、降血压、抗过敏、抗癌、抗艾滋病、防痴呆症、防糖尿病等诸多功效，也常被用做利尿通便剂、兴奋剂和催乳剂，具有很高的医学研究价值。目前，国内外对明日叶中查尔酮的提取大多采用的是溶剂浸提法，但暴露出很多问题，如能量消耗大、提取时间长、提取率低等问题，而新兴技术如超声波提取技术、微波提取技术等具有简单方便、提取时间短、提取率高等优点，目前尚未见超声波辅助提取明日叶中查尔酮的工艺研究报道。本文采用超声波辅助提取工艺对明日叶中的查尔酮进行提取研究，通过正交试验优化提取条件[9]，并对明日叶中查尔酮含量进行测定，为明日叶的进一步开发利用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明日叶：购自山东明日叶庄园；查尔酮标准品：由上海阿达玛斯有限公司生产；无水乙醇和石油醚均为分析纯：由天津市富宇精细化工有限公司生产；甲醇为色谱纯：购于Sigma公司；JY92-IIN超声波细胞破碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；EYELER离心浓缩仪：日本东京理化器械株式会社；LGJ-12冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 查尔酮标准曲线的绘制

确称取查尔酮标准品5 mg，用甲醇定容50 mL容量瓶中，配成100 μg/mL的标准储备液，吸取该标准储备液 0.1、0.2、0.5、1、2 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，配置成 1、2、5、10、20 μg/mL 的查尔酮标准溶液。用紫外可见分光光度计分别对1、2 μg/mL的标准品溶液进行全波段扫描，在308 nm处显示最大吸收，并呈现出计量关系，选定308 nm为最大吸收波长。在波长为308 nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，建立吸光度和浓度之间的线性关系，绘制标准曲线，得出回归方程：y＝0.079 8x-0.011 1，R2＝0.999 5，如下图1所示。

图1 查尔酮标准曲线Fig.1 The standard curve of chalcone

1.2.2 样品处理

新鲜的明日叶茎叶用去离子水反复冲洗，冲洗后于50℃鼓风干燥箱中干燥24 h，粉碎，研磨，过40目筛。干燥至恒重，储存于干燥器中备用。

1.2.3 明日叶中查尔酮的提取与测定

称取0.5 g明日叶干粉，置于玻璃试管中，加入提取溶剂乙醇溶液[10]，水浴控温，设定提取条件，用超声波细胞破碎机对明日叶查尔酮进行辅助提取。提取液离心，取上清液，用2 mL～3 mL溶剂洗涤滤渣，离心，吸取上清液，合并提取液；利用石油醚反复萃取提取液[11]，去除其中的叶绿素，直至石油醚无色；将滤液离心浓缩，冷冻干燥，得到明日叶中查尔酮的粗提取物，用甲醇转移定容至25 mL容量瓶中作为待测溶液。取1 mL待测液用甲醇定容至10 mL容量瓶中，用紫外一可见光分光光度计在308 nm波长下测定吸光度，代入回归方程，计算查尔酮得率。

1.2.4 单因素试验

准确称取明日叶干粉0.5 g，置于玻璃试管中，超声波辅助提取，以明日叶查尔酮得率为指标，分别研究超声功率、乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间对明日叶查尔酮得率的影响。

1.2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，对超声功率、乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间进行5因素3水平正交试验，分析各因素影响的主次并确定其最优提取工艺参数。每次实验做3个平行样，结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声功率对查尔酮提取效果的影响

超声功率分别选用 100、200、300、400、500 W，实验在料液比1∶40、乙醇浓度为70%、冰浴、提取时间30 min（工作3 s，间歇5 s）的条件下进行。

图2 超声功率对提取效果的影响Fig.2 Effects of ultrasonic power on the extracting result

结果如图2所示，随着功率提高，吸光度上升，当功率为300 W时，提取效果最好，随后随着功率的升高，提取效果反而下降。这可能是因为功率太大时，超声工作期间产热越高，提取物被破坏，溶剂蒸发过快，导致提取效率下降。所以选择300 W为最佳提取功率。

2.1.2 不同浓度乙醇对提取效果的影响

用于明日叶有效成分的提取溶剂有甲醇、正己烷、丙酮、乙醇等，由于甲醇、正己烷、丙酮、对人体健康不利，并且乙醇可有效降低查尔酮酶的活性，避免提取时查尔酮的分解，故选择乙醇作为提取溶剂。适当浓度的乙醇溶液可以大大增加提取物在提取液中的溶解度，从而减少溶剂用量，增大提取效率。实验分别选用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，其余条件为超声功率300 W，料液比1∶40，冰浴，提取时间30 min（工作 3 s，间歇 5 s）。

图3 乙醇浓度对提取效果的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on the extracting result

结果如图3可知，明日叶中的查尔酮提取效果随乙醇浓度的增加而升高，浓度达到70%时提取效果最好，之后提取效果反而下降了。这可能是由于乙醇浓度过高时，溶剂极性下降，查尔酮的溶解度下降，不利于查尔酮的溶出。同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，与查尔酮竞争与溶剂的结合，从而导致提取效果下降。

2.1.3 不同提取温度对提取效果的影响

合适的提取温度能加快提取物的溶出，但温度过高，不仅增大了能耗，还有可能导致提取物的分解，从而降低了提取效率。实验在超声功率300 W，料液比1 ∶40，乙醇浓度 70%，提取时间 30 min（工作 3 s，间歇5 s）的条件下，分别探讨 50、60、70、80 ℃的提取温度对提取效率的影响。

图4 提取温度对提取效果的影响Fig.4 Effects of extraction temperature on the extracting result

结果如图4所示，明日叶中的查尔酮提取效果随提取温度的上升而升高，温度达到70℃时提取效果最好，之后提取效果反而下降，故选择70℃为最佳提取温度。

2.1.4 不同料液比对提取效果的影响

料液比高必然会增大两相间浓度差，增大传质推动力，提取效率也会相应增大，但也会提高生产成本及增加后续处理的难度。在超声功率为300 W，乙醇浓度为70%，提取温度为70℃，提取时间30 min（工作3 s，间歇5 s）的实验条件下，料液比分别选用 1∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70 进行实验。

图5 料液比对提取效果的影响Fig.5 Effects of solid to liquid ratio on the extracting result

实验结果如图5所示，随料液比的增大，提取效果越好，但当液料比达到1∶40后，增加缓慢，考虑到提取率、生产成本和后续处理难度的问题，实验确定最佳料液比为1∶40。

2.1.5 不同提取时间对提取效果的影响

实验在超声功率300 W，乙醇浓度为70%，提取温度为70℃，液料比为1∶40的前提下，分别提取10、20、30、40、50 min（工作 3 s，间 5 s）。

图6 提取时间对提取效果的影响Fig.6 Effects of extraction time on the extracting result

实验结果如图6所示，当提取时间为10 min～20 min时，随超声波作用时间的延长，查尔酮吸光值逐渐增大，但超声波处理时间超过20 min后吸光值有明显下降，这可能是长时间处理导致溶剂挥发的缘故，当提取时间为20 min时，提取效果最好。

2.2 正交试验结果

根据以上单因素实验结果，选取超声功率、乙醇浓度、提取温度、液料比、提取时间按5因素进行正交实验设计，以确定超声辅助提取明日叶中查尔酮的最佳工艺。正交实验因素水平表见表1，实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

由表2的极差分析和表3的方差分析结果可知，料液比对明日叶查尔酮提取量影响最大，其次为乙醇浓度和提取温度，提取时间和超声功率对其影响较小。表3方差分析结果表明：在95%置信水平下，从明日叶提取查尔酮的工艺参数中，功率和时间对明日叶提取效率影响不显著，浓度、温度和料液比影响显著。综合极差分析和方差分析可知本实验的最佳工艺为A2B2C1D3E2，即超声波功率300 W，乙醇浓度为70%，提取温度为50℃，料液比为1∶50，超声时间为20 min。

表2 正交试验结果表Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Table 3 Results of analysis of variance

2.3 工艺验证

取3份试样各0.5 g，按最佳提取方法进行提取，吸光值分别为1.096，1.110，1.104。计算得明日叶中查尔酮得率为6.98 mg/g。均高于正交试验中各实验组合的查尔酮得率，与正交试验分析结果相符。

2.4 明日叶中查尔酮提取率的测定

在最佳的提取工艺条件下，对明日叶中的查尔酮的提取率进行测定。结果见图7。

图7 提取次数对提取效果的影响Fig.7 Effects of extracting times on the extracting result

由图7可知，随着提取次数的增加，查尔酮的提取率也增加。但提取次数超过2次后，查尔酮的提取率增加很少，所以在最佳的提取工艺条件下，提取2次后吸光值为1.191，明日叶查尔酮的得率为7.53 mg/g。

3 结论

本文所探讨的5个因素超声功率、乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间，对明日叶查尔酮提取量的影响主次顺序是：料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞超声功率。提取工艺条件为超声波功率300 W，乙醇浓度70%，提取温度为50℃，料液比为1∶50，提取时间为20 min。在此条件下提取2次，明日叶中查尔酮得率为7.53 mg/g。

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