超声波辅助提取新疆阿魏菇蛋白质工艺优化

牛博楠，许程剑，刘冰，何月，王思月

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

阿魏菇（Pleurotus ferulae）是新疆特有的菌类，其因寄生或腐生在中药阿魏肥大的根茎部而得名。在我国阿魏菇仅分布于新疆荒漠地区的木垒、托里、阿勒泰、伊梨、塔城等地，与其寄主阿魏的分布是一致的[1]。阿魏菇集食用、药用、美容于一身，营养丰富全面并且各类营养物质含量都很高[2-3]，被誉为当今食用菌“皇后”。阿魏菇菇体洁白高大，肉质细腻鲜嫩，味美可口，营养丰富，其蛋白质含量占干菇的20%，含有18种氨基酸，人体8种必需氨基酸全部具备。其除含有丰富的蛋白质、多糖、脂肪酸外，还含有丰富的维生素（主要含VD）、食用纤维，并富含钙、铁、锌、锰等多种矿质元素和微量元素。阿魏菇还在抗肿瘤，抗疲劳，抗诱变，免疫调节[3-5]等各方面都有良好的开发利用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

阿魏菇（新疆清河）；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、无水乙醇、磷酸、浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸 均为分析纯。

KQ-200VDE双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UV759紫外可见分光光度器：上海精科；BS2000电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；LG100B鼓风干燥箱：上海实验仪器厂；Neofuge15R台式高速冷冻离心机：香港力康；打浆机。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质标准曲线的绘制

用牛血清蛋白（BSA）为标准品，运用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，绘制蛋白质标准曲线。

1.2.2 阿魏菇蛋白提取的工艺流程

新鲜阿魏菇——洗净切片——打浆——超声波浸提——离心——上清液考马斯亮蓝法测定蛋白含量

1.2.2.1 阿魏菇

选择成熟适当，菇体洁白，新鲜无异味的阿魏菇，清洗后切片，用保鲜膜包裹后存放于4℃冰箱中。

1.2.2.2 打浆

称取适当阿魏菇，用剪刀剪碎，加入等质量的蒸馏水，打浆3 min。

1.2.2.3 离心

将浸提后的浆体以7 000 r/min下离心15 min。

1.2.3 阿魏菇总蛋白含量的测定

参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》，运用凯氏定氮法测定阿魏菇中蛋白的含量。

1.2.4 提取工艺

1.2.4.1 单因素试验

选择影响蛋白得率的几个因素：超声温度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）、液料比（2、3、4、5、6 mL/g）、超声 时 间（2、5、10、15、20 min）、pH（9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13）进行单因素试验，分别考察各因素对阿魏菇蛋白得率的影响。

1.2.4.2 响应面优化试验

在单因素的基础上，选取对阿魏菇蛋白得率影响大的3个因素，采用响应面分析软件Design-Expert.8.05建立三因素五水平的Central Composite模型，通过试验确定最优提取工艺。变量因素编码及水平见表1。

表1 响应面自变量因素编码及水平Table 1 Factors and levels in response surface test

1.2.5 阿魏菇蛋白等电点的测定

将碱溶的上清液的 pH 分别调到 2.5、3、3.5、4、4.5、5，静置30 min，离心，测定上清液蛋白含量，蛋白含量最少的即为阿魏菇蛋白的等电点。

2 结果与分析

2.1 蛋白含量测定的标准曲线

运用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，以BSA为标品，绘制蛋白质的标准曲线如图1所示，建立的回归方程为y=0.007 8x+0.017 7，其中y为595 nm处测得的吸光度，x为BSA 的浓度（μg/mL），R2=0.998 4。

图1 蛋白含量测定的标准曲线Fig.1 The standard curve of protein content

2.2 单因素试验结果

2.2.1 超声波温度对阿魏菇蛋白提取率的影响

在pH为9，超声时间为30 min，液料比为4 mL/g，超声温度对阿魏菇蛋白提取率的影响如图2所示。

图2 超声温度对阿魏菇蛋白提取率的影响Fig.2 Influence of ultrasonic temperature on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

从图2可以看出，阿魏菇蛋白的得率随着超声温度的提高呈上升趋势，在温度30℃时提取率达到最大11.093%，超声温度继续升高时，阿魏菇提取率呈明显的下降趋势，可能是由于蛋白质在高于30℃后容易受热导致变性，使有些已水解的蛋白质发生交联和聚合，反而降低蛋白的溶解度[6]。

2.2.2 液料比对阿魏菇蛋白提取率的影响

在超声温度30℃，超声时间30 min，pH9，液料比对阿魏菇蛋白提取率的影响如图3所示。

图3 液料比对阿魏菇蛋白提取率的影响Fig.3 Influence of Liquid ratio on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

如图3所示，随着液料比的增大，阿魏菇蛋白提取率呈上升趋势，在液料比为4 mL/g时达到最大11.733%，当液料比继续增大时，蛋白提取率趋于稳定。过大的液料比增加水的用量和后续浓缩难度[7]，选择最适液料比为4 mL/g。

2.2.3 超声时间对阿魏菇蛋白提取率的影响

在超声温度30℃，液料比4 mL/g，pH9，超声时间对阿魏菇蛋白提取率的影响如图4所示。

图4 超声时间对阿魏菇蛋白提取率的影响Fig.4 Influence of ultrasonic time on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

由图4可知，阿魏菇蛋白提取率随着超声时间的延长而增大，当时间到达10 min时提取率率达到最大为15.638%，当超声时间继续增加时，提取率明显降低，可能是由于长时间超声空化作用导致蛋白变性[8]，使提取率降低。

2.2.4 pH对阿魏菇蛋白提取率的影响

在超声温度30℃，超声时间10min，液料比4mL/g，pH对阿魏菇蛋白提取率的影响如图5所示。

图5 pH对阿魏菇蛋白提取率的影响Fig.5 Influence of pH on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

图5可以看出，阿魏菇蛋白的提取率随着pH的增大而增大，当pH到达10时出现了第一个高峰，随着pH的继续增大，蛋白提取率呈下降趋势，之后又有缓慢的上升趋势。但pH由12再继续增大时，蛋白提取率增大明显。但考虑到随着pH的增大，氨基酸之间有可能发生缩合反应产生异味[9]使蛋白变性，综合考虑，选择最适pH为10。

2.3 阿魏菇蛋白等电点的测定结果

上清液中蛋白含量越少表明沉降的蛋白量越多，由图6可以看出，阿魏菇蛋白的等电点为pH4。

图6 阿魏菇蛋白等电点的精确测定Fig.6 The accurate determination of isoelectric point on Pleurotus ferulae protein

2.4 响应面优化分析

表2 工艺参数响应面实验设计与结果Table 2 Design and results in response surface test of process parameters

表3 蛋白质提取率回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance to the extraction ratio of protein

对表2中的实验数据进行多元回归拟合[9]，得到了阿魏菇蛋白提取率对超声温度（A）、超声时间（B）、液料比（C）的二次多项式的回归模型如下：

得率=16.91-0.034A-0.94B+0.83C-0.29AB-0.47AC-0.75BC-1.50A2-1.42B2-0.59C2

由表3中的回归模型的方差分析可知，模型的P＜0.000 1，失拟项的 P=0.216 3＞0.05，不显著，表明建立的该模型可以用来分析和预测阿魏菇蛋白提取的工艺参数。同时由表3中的回归模型显著性分析可知，B、C、AC、BC、A2、B2、C2对阿魏菇蛋白得率的影响显著，A、AB对阿魏菇蛋白得率的影响不显著。

由图8可得，等高线图呈椭圆形，说明超声时间和液料比之间的交互作用显著，由超声时间和液料比的3D图可看出，阿魏菇蛋白提取率随液料比变化的坡度较陡，彼此之间的交互作用较显著，与回归模型的方差分析结果相符。

由图9可得，超声温度和液料比的等高线图呈椭圆形，说明两者之间的交互作用较显著，并且由超温度和液料比的3D图可知，阿魏菇蛋白提取率随液料比变化的坡度较陡，液料比对其影响较大，两者之间的交互作用较显著。

2.5 响应面结果验证试验

图7 时间与温度互作用等高线和响应面图Fig.7 Curved surface chart of time and temperature

图8 时间与液料比互作用等高线和响应面图Fig.8 Curved surface chart of time and liquid to solid ratio

图9 温度与液料比互作用等高线和响应面图Fig.9 Curved surface chart of temperature and liquid to solid ratio

由模型方程计算可得，阿魏菇蛋白提取率的最优实验方案为pH10、超声温度27.09℃、超声时间9.45 min、液料比5mL/g，在此条件下的蛋白提取率的理论值达到17.68%。根据试验的实际情况将实验条件调整为pH10、超声温度27℃、超声时间10min、液料比5mL/g，重复试验3次，最终得到的阿魏菇蛋白提取率的平均值为17.59%，与理论值基本一致。结果表明，该模型可以较好地反映出阿魏菇蛋白提取的条件，从而也证明了响应曲面法优化提取阿魏菇蛋白条件参数的可行性。

3 结论

采用Central Composite设计，建立了超声波辅助碱溶酸沉法提取阿魏菇中蛋白质工艺参数的二次多项式数学模型，经验证该模型是合理可靠的，能够较好地预测阿魏菇蛋白的提取率。阿魏菇蛋白提取的优化工艺条件为pH10、超声温度27℃、超声时间10 min、液料比5 mL/g，提取率达到17.59%。

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