调节性T细胞在健康人群中的表达

周文超，李薇，熊小敏

1.广州军区 广州总医院检验科，广州军区 检验中心，广东 广州 510010；2.广州中医药大学，广东 广州 510405

Sakaguchi等于1995年首次提出CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）是一种具有免疫抑制/调节作用的细胞群；2003年，Treg细胞被正式确认为独立的T细胞亚群。Treg细胞与感染、肿瘤、移植、自身免疫性疾病等多种疾病密切相关[1-2]。

CD4+CD25+Treg细胞特异性表达Foxp3（fork⁃head/winged helix transcription factor 3，叉头状/翼状螺旋转录因子3），Foxp3与Treg细胞的发育和功能密切相关，同时也是维持其免疫抑制功能的必要条件[3]。目前公认Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞特有的细胞标志。CD4+CD25+Treg细胞高表达Foxp3，而只有很少的其他细胞表达Foxp3[4]。由于Foxp3位于细胞内，检测时需要打孔破膜，影响细胞活性，目前的技术尚不能直接分离活的Foxp3阳性细胞。2006年Liu等[5]发现，CD127（IL-7受体）与Foxp3的表达有相关性。Seddiki等[6]发现，CD4+T细胞活化后高表达CD127，而Treg细胞则低表达CD127（CD4+CD25highCD127dim），因此CD127可以帮助识别Treg细胞与活化的T细胞。王会平等[7]报道，CD4+CD25+CD127low三标记法是检测Treg细胞的最理想指标。目前少见有关CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的正常人参考范围的报道，迄今有关CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的报道大部分是对照组与不同疾病组进行比较，且所有有关对照组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的表达范围均不相同。为此，我们采用流式细胞术，对2011年12月～2012年8月来我院健康体检的人群外周血单个核细胞中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的表达水平进行了调查分析，以此建立本实验室健康成年人外周血中的参考范围，方便我院临床医生对移植、肿瘤等相关疾病的研究，期望能够为临床治疗、判断病程预后提供有价值的数据。

1 材料与方法

1.1 观察对象

收集2011年12月～2012年8月广州军区广州总医院体检中心健康成年人外周血标本180例，这些观察对象在本院体检期间血常规、尿常规、生化、肝功能、肾功能、肿瘤标志物等各项指标均在正常范围内；心电图、胸部X线检查、腹部B超影像分析均未见明显异常；无明显的心、脑血管疾患，故视为健康人群。其中男99例、女81例，年龄17～84岁，平均43.64岁。根据性别分为男女2组；根据不同年龄段分为17～29岁（n=51）、30～39岁（n=34）、40～49岁（n=24）、50～59岁（n=36）、≥60岁（n=35）共5个组，依次编为1、2、3、4、5组。

1.2 其他材料

CD4-FITC、CD25-PE、鼠抗人 CD127-PerCPCy5.5、鼠IgG1-PE、鼠IgG1-PerCP-Cy5.5、溶血剂、鞘液、流式细胞仪BD FACS Calibur、细胞分析管（BD Biosciences公司）；TL-5.0w台式离心机（上海市离心机械研究所有限公司）。

1.3 方法

清晨空腹采取EDTA-K3抗凝静脉血2 mL，每份标本设测定、同型对照2管，于测定管中加入CD4-FITC、CD25-PE 各 10 μL、鼠抗人 CD127-PerCPCy5.5 2 μL；同 型 对 照 管 中 加 入 CD4-FITC、鼠IgG1-PE 各 10 μL，鼠 IgG1-PerCP-Cy5.5 2 μL；分别于2管中各加入100 μL抗凝血剂后振荡混匀，室温避光标记15 min；加入1 mL溶血剂，振荡混匀，室温避光溶血10 min；2000 r/min离心2 min，弃上清液，加鞘液1 mL，2000 r/min离心2 min，弃上清液，加鞘液500 μL，充分混匀后上机分析。用Cell⁃quest软件，以同型对照管CD4/SSC散点图中CD4+FITC细胞群设门，确定鼠IgG1-PE/鼠IgG1-PerCPCy5.5散点图中的阴性区域，分析测定管Cellquest图中右下象限CD25+CD127low细胞群阳性百分率。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。

2 结果

2.1 不同性别健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的百分率

用Levene检验方差齐性，结果显示方差齐（F=0.321，P=0.572），采用独立样本的 t检验，不同性别健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞百分率男、女分别为（4.06±1.56）%和（3.59±1.48）%，无显著性差异（P＞0.05）。

2.2 不同年龄段各组间外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的百分率

应用单向方差分析，各组间进行两两比较，结果显示1、2、3组间无显著性差异（P＞0.05），4、5组间无显著性差异（P＞0.05）；1、2、3组分别与4、5组间具有显著性差异（P＜0.05）。参见表1。

2.3 健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞百分率参考范围的确定

统计结果显示，不同性别健康成年人CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的百分率无显著性差异；17～49岁不同年龄段3组间无显著差异，≥50岁2组间亦无显著差异，而这2个年龄段之间则存在显著性差异。根据统计分析结果，CD4+CD25+CD127lowTreg细胞参考范围在实际使用中可忽略性别，但须依据17～49岁、≥50岁2个年龄段设不同的截断值，具体范围确定为≤49岁为（3.30±1.45）%，≥50岁为（4.69±1.27）%。参见表2、图1。

3 讨论

CD4+CD25+CD127lowTreg细胞与肿瘤、移植疾病、自身免疫性疾病等密切相关，在不同的疾病中有升高或降低的趋势。以往有关Treg细胞的研究中，多以CD4+CD25+细胞群中的Foxp3为主。Foxp3被认为是特异性表达于CD4+CD25+Treg细胞的关键标记分子，在一定程度上可反映CD4+CD25+Treg细胞的水平和功能活性，可作为证实CD4+CD25+Treg细胞的表面标志[8-9]。但由于Foxp3是在细胞内表达，检测分析时须破膜打孔，检测过程长、复杂，且易影响细胞活性及丢失细胞数目，从而影响检测结果的准确性[10]。2006年Liu等发现CD127（IL-7受体）与Foxp3的表达呈负相关。与此同时，Seddiki等发现CD127可以帮助识别CD4+CD25+Treg细胞与活化的T细胞，CD4+T细胞活化后高表达CD127（CD4+CD25+CD127high），而真正的Treg细胞仅表达较低的CD127（CD4+CD25+CD127low）。因此，在 CD4+CD25+基础上联合CD127抗原，可以更好地识别人CD4+CD25+Treg细胞[7]。迄今在有关CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的研究中，少见该指标参考范围的报道，多建立在疾病观察组与对照组比较上[11-13]。国内郭新红等[11]报道健康对照组为（4.02±1.66）%，严波等[12]报道健康对照组为（6.027±0.854）%，结荆线等[13]报道健康对照组为（3.21±0.96）%，王盈等[14]报道健康人为（6.55±0.11）%，Zhang 等[15]报道健康对照组为（5.44±1.44）%，Guo 等[16]报道 健 康对照组（2.5±0.9）%。综上，有关CD4+CD25+CD127lowTreg细胞指标的报道不尽一致。本研究结果显示，CD4+CD25+CD127lowTreg细胞指标男性略高于女性，但经过统计学分析，性别之间无显著差异，表明该指标在应用于临床时可以忽略性别。本研究还显示，17～49岁间3个年龄段无显著性差异，≥50岁的2个年龄段无显著差异，而17～49岁与≥50岁2个年龄段间则存在显著差异，表明临床应用该指标时应根据17～49岁及≥50岁设2个不同的截断值为参考范围。

表1 不同年龄段健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的百分率（x±s）

表2 健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127low Treg细胞的百分率（x±s）

本实验数据与有关报道存在差异[11～16]，可能与地域、试剂、标本的选择有关。本研究建立的CD4+CD25+CD127lowTreg细胞健康成年人表达范围具前瞻性与创新意义，可用于肿瘤、器官移植、慢性特发性血小板减少性紫癜等多种疾病的临床治疗与疗效观察，并对疾病的病程转归具有一定的探讨价值。由于年龄大于50岁的人群或多或少存在某些慢性疾患，真正意义上的健康人标本来源较少，存在一定的局限性，有待于后续研究中加以补充完善。

图1 流式细胞术检测≤49岁与≥50岁健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的表达范围

[1] 邓茜,肖影群.CD4+CD25+调节性T细胞及其在肝病的研究进展[J].重庆医学,2012,41(10):1004-1006.

[2] 何凡,陈知水,陈孝平,等.术前调节性T细胞水平与肝癌肝移植术后肿瘤复发的关系[J].外科理论与实践,2008,13(4):341-343.

[3] Shevach E M.Mechanisms of foxp3+T regulatory cell-mediat⁃ed suppression[J].Immunity,2009,30:636-645.

[4] Pacholczyk R,Kraj P,Ignatowicz L.Peptide specificity of thy⁃mic selection of CD4+CD25+T cells[J].Immunology,2002,168(2):613-620.

[5] Liu W,Putnam A L,Zhou X Y,et al.CD127 expression in⁃versely correlates with FoxP3 and suppressive function of hu⁃man CD4+T reg cells[J].J Exp Med,2006,203(7):1701-1711.

[6] Seddiki N,Santner-Nanan B,Martinson J,et al.Expression of interleukin(IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cell[J].J Exp Med,2006,203:1693-1700.

[7] 王会平,翟志敏,张爱梅,等.CD4+CD25+CD127low识别人外周血CD4+CD25+调节性T细胞的优势[J].中国免疫学杂志,2008,24(12):1059-1062.

[8] Yagi H,Nomura T,Nakamura K,et al.Crucial role of Foxp3 in the development and function of human CD4+CD25+regula⁃tory T cells[J].Int Immunol,2004,16(11):1643-1656.

[9] Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of regulatory T cell developmentby the transcription factorFoxP3[J].Science,2003,299(5609):1057-1061.

[10]Morgan M E,van Bilsen J H,Bakker A M,et al.Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+T regulatory cells in humans[J].Hum Immunol,2005,66(1):13-20.

[11]郭新红,范佳鑫,阿依姆妮萨,等.CD4+CD25+CD127low调节性T细胞及相关细胞因子与慢性特发性血小板减少性紫癜的研究[J].中国免疫学杂志,2011,27(1):73-75.

[12]严波,燕善军.恶性肿瘤患者腹水及外周血中CD4+CD25+CD127low调节性T细胞表达及其意义[J].实用医学杂志,2010,26(9):1570-1571.

[13]结荆线,乔丽娟,郭爱芝,等.卵巢癌患者外周血CD4+CD25hiCD127lo调节性T细胞格局变化及临床意义[J].中国免疫学杂志,2012,28(1):49-53.

[14]王盈,周磊明,宫菊丽,等.中国健康人外周血中具有CD4+CD25nt/hCD127low特征的调节性T细胞频率[J].细胞与分子免疫学杂志,2007,23(9):816-819.

[15]Zhang Shenghui,Han Yixiang,Wu Jianbo,et al.Elevated fre⁃quenciesCD4+CD25+CD127lowregulatory T cells is associated to poor prognosis in patients with acute myeloid leukemi[J].Int J Cancer,2011,129(6):1373-1381.

[16]Guo Y,Wu C Z,Liao Y,et al.The Expression and signifi⁃cance of CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells and Foxp3 in patients with portal hypertension and hypersplenis[J].Hepato⁃gastroenterology,2013,60(123):581-584.