含p53保守结合位点的microRNA表达载体的构建及应用

秦性良，苏雪婷，丁红梅，黄皑雪，李慧，侯绿滨，葛兴枫，李洁，邵宁生

1.广西医科大学，广西 南宁 530021；2.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850

经过数十年深入研究，人们发现p53在多种肿瘤应激相关分子网络中处于核心地位[1-2]。p53作为一种能够与DNA结合的特异转录因子，在DNA损伤、药物作用、原癌基因激活等多种应激信号下被活化，进而调控下游靶基因，参与DNA损伤修复、细胞周期调节等一系列重要生命过程[3]。p53特异性DNA结合位点通常由2条长度约10 bp的序列组成，序列模式为5'-RRRCWWGYYY（N）RRRCWW⁃GYYY-3'（R=A或G，W=A或T，Y=C或T），2个拷贝间由0～13个随机碱基隔开（N=0～13 nt）。

microRNA（miRNA）是一类长约19～25 nt的单链非编码小RNA，在进化过程中高度保守。这类内源性非编码小RNA分子主要通过与靶基因mRNA的3'UTR结合，导致靶mRNA降解或抑制其翻译，从而调控基因表达[4-6]。越来越多的证据表明，miRNA调控靶基因通路与p53信号通路相互交叉并相互影响。2006年，Voorhoeve等通过遗传学手段筛选人miRNA，首次发现miRNA参与p53信号通路[7]。随后Xi等分析HCT-116细胞系表达谱发现，表达水平存在显著差异的326条miRNA中，46%的miRNA在其上游5 kb预测启动子区内含有p53结合位点，这一发现表明p53调控miRNA表达的可能性[8]。随后，有5个相互独立的研究小组相继报道了miR-34家族与p53的相互作用，揭开了miRNA参与p53信号通路、p53调控miRNA生物合成的相互作用关系。随后越来越多能够参与p53信号通路的miRNA被发现，如miR-34家族（miR-34a，miR-34b，miR-34c）、miR-29家族（miR-29a，miR-29b，miR-29c）、miR-125b、miR-145、miR-192、miR-215、miR-194 和miR-21l等[9-10]。

基于上述研究基础，我们利用p53的转录激活活性，构建含有p53保守结合位点的高效miRNA表达载体，希望实现在表达野生型p53的细胞中对靶标进行有效调控。本研究选用3条人源miRNA，即miR-138、miR-34a和miR-21及其各自对应的已有文献报道的靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN[11-13]来证实这一方法。

1 材料与方法

1.1 材料

人非小细胞肺癌H1299细胞和人宫颈癌上皮细胞HeLa由本实验室保存；miRNA表达载体pCMV-miR购自OriGENE公司；p53真核表达载体购自义翘神州公司；siRNA由上海吉玛公司合成。

DMEM和1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；TRIzol和LipofectAMINE2000购自Invitrogen公司；限制性内切酶AscⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅤ，M-MLV反转录系统，SYBR GreenⅠ荧光定量PCR系统，质粒提取试剂盒购自Promega公司；pfu高保真酶、dNTP及相关缓冲液购自天根公司；其他试剂均为进口分装或国产分析纯产品；所有引物及其他DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 载体构建

分别合成3条具有p53保守结合位点的DNA序列，用BamHⅠ和AscⅠ双酶切pCMV-miR载体和p53结合位点序列，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单克隆测序鉴定（由中美泰和生物公司完成），将所获阳性克隆质粒命名为pCMV/p53-miR。

以H1299细胞基因组为模板，PCR扩增miR-138、miR-34a、miR-21 前体序列，分别得到 135、146、108 bp的DNA片段，经12%PAGE，乙醇沉淀法切胶回收纯化，将回收的DNA片段用XhoⅠ和EcoRⅤ双酶切后构建到pCMV-miR和pCMV/p53-miR载体中，分别命名为pCMV-miR-138、pCMV/p53-miR-138、pCMV-miR-34a、pCMV/p53-miR-34a、pCMV-miR-21和pCMV/p53-miR-21。

1.3 细胞培养及转染

在37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HeLa细胞，用含10%胎牛血清的1640培养基培养H1299细胞，采用胰酶消化法进行细胞传代。将生长状态良好的HeLa或H1299细胞接种于24孔板中，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养24 h，将质粒DNA、Lipo⁃fectAMINE2000按照说明书的比例分别稀释于50 μL无血清培养基中，然后将两者轻轻混合，室温放置20 min，用无血清培养基洗24孔板细胞2次，加入400 μL无血清培养基后，将质粒-转染试剂混合物轻轻加入24孔板细胞，混匀，培养4 h，更换为含血清的正常培养基，继续培养48 h，收取细胞进行后续实验。转染实验用500 ng质粒、20 nmol/L p53 siRNA（AAGACUCCAGUGGUAAUCUACdTdT）。

1.4 RNA的提取及其完整性、浓度鉴定

用TRIzol试剂提取细胞总RNA，将提取的RNA稀释至1/50，在紫外分光光度计上检测RNA浓度及D260nm/D280nm值，取1 μg RNA用1%琼脂糖电泳鉴定RNA的完整性。

1.5 逆转录及实时荧光定量PCR

1.5.1 逆转录获得cDNA 取1 μg 细胞总RNA样品，加入1 μL oligo（dT），用DEPC水补足至11 μL，70℃变性5 min后立即置冰上退火，之后加入如下试剂的混合物［5×M-MLV逆转录缓冲液4 μL，dNTP（25 mmol/L）2 μL，M-MLV 逆转录酶 1 μL，RNase抑制剂 0.5 μL］，组成 20 μL 的反应体系，42℃反应90 min后95℃处理10 min以灭活逆转录酶，置-20℃备用。

取1 μg细胞总RNA样品加尾，25 μL反应体系包括 QmiR-RT（GCGAGCACAGAATTAATACGACT⁃CACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN）（500ng/μL）1 μL、10×大肠杆菌 poly（A）聚合酶缓冲液 2.5 μL、2.5 mmol/L MnCl22.5 μL、dNTP（25 mmol/L）2.5 μL、100 mmol/L ATP 2.5 μL、M-MLV 逆转录酶1 μL、大肠杆菌poly（A）聚合酶1 μL、RNase抑制剂0.5 μL，37℃反应90 min后95℃处理10 min以灭活酶，置-20℃备用。

1.5.2 实时荧光定量PCR 用安捷伦公司的Strata⁃gene MX3000P荧光定量PCR仪和SYBR Green PCR MasterMix对miR-138、miR-34a、miR-21及其各自靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的mRNA水平进行检测，特异性引物序列见表1。采用MX3000P软件进行分析。

1.6 Western印迹检测

转染48 h后收集细胞，加入适量RIPA裂解液［50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150 mmol/L NaCl，1%NP-40，1%去氧胆酸钠，1 mmol/L EDTA，0.1%SDS，0.2 mmol/L PMSF，1 μg/mL蛋白酶抑制剂］于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清，用BCA法测定蛋白质浓度，用12%SDSPAGE分离蛋白；转膜至PVDF膜，用1×TBST配制5%的脱脂奶粉封闭1 h，根据一抗说明书稀释一抗，室温孵育2 h，1×TBST洗4次，每次10 min，室温孵育山羊抗兔带HRP标记的IgG（1∶8000稀释），洗膜5次，每次10 min，用增强发光液在化学发光成像系统中发光显色。

表1 实时荧光定量PCR中的引物序列

2 结果

2.1 含有p53保守结合位点的miRNA表达质粒的构建

通过生物信息学网站TP53 database数据库（http://p53.iarc.fr/）选取 3 条经典的 p53保守结合位点序列（图1）。

图1 p53保守结合位点生物信息学分析

将合成的带有酶切位点的p53结合位点序列经BamHⅠ和AscⅠ酶切处理，插入pCMV-miR载体，命名为pCMV/p53-miR；以H1299细胞基因组为模板，通过 PCR获得miR-138、miR-34a、miR-21前体序列，得到135、146、108 bp的DNA片段（图2）；将扩增的片段经XhoⅠ和EcoRⅤ双酶切后插入pCMV/p53-miR质粒，命名为pCMV/p53-miRNA。

图2 天然胶PAGE鉴定miR-138、miR-34a和miR-21前体序列M：pUC18 marker；1：miR-138；2：miR-34a；3：miR-21

以pCMV-miR载体为对照，将改构的miRNA表达载体转染HeLa细胞48 h后，用qRT-PCR检测miR-138、miR-34a和miR-21的表达量，结果见图3。相对于商业化的pCMV-miR载体，pCMV/p53C-miRNA表达载体能够更加高效地表达miR-138、miR-34a和miR-21。

图3 HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平（**P＜0.01）

2.2 利用pCMV/p53C-miRNA载体检测miR-138、miR-34a和miR-21对其各自靶基因的调控

2.2.1 HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21对各自靶基因的调控 在具有野生型p53的HeLa细胞中，我们选取了pCMV/p53C-miRNA与商业化的pCMV-miR载体来比较miR-138、miR-34a和miR-21对各自靶基因的调控作用效果。结果显示，向HeLa细胞中转染pCMV/p53C-miR-138、pCMV/p53C-miR34a、pCMV/p53C-miR21后，Cyclin D3、CDK2、PTEN无论在mRNA水平还是蛋白水平的下调都最为明显（图4）。

用siRNA沉默HeLa细胞中的p53基因，靶基因Cyclin D3、CDK2、PTEN的表达量下调无明显变化（图5），提示pCMV/p53C-miRNA表达载体在野生型p53存在的条件下才能更好地促进miRNA表达。

2.2.2 H1299细胞中miR-138、miR-34a、miR-21对各自靶基因的作用效应检测 在不表达p53的H1299细胞中，同样用pCMV/p53C-miRNA与商业化的pCMV-miR载体比较了miR-138、miR-34a和miR-21对各自靶基因的作用效果。向H1299细胞中转染 pCMV/p53C-miR138、pCMV/p53C-miR34a、pCMV/p53C-miR21后，Cyclin D3、CDK2、PTEN无论在mRNA水平还是蛋白水平的下调程度都与商业化miRNA表达载体无明显差别；而在H1299细胞中将改构的miRNA表达载体与p53真核表达载体共转染后，靶基因Cyclin D3、CDK2、PTEN无论在mRNA水平还是蛋白水平的下调都更为明显（图6）。

图4 HeLa细胞中过表达miR-138、miR-34a和miR-21后对靶基因的作用A：实时荧光定量PCR检测HeLa细胞中用miRNA表达载体过表达miR-138、miR-34a和miR-21后各自对应靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的mRNA表达水平，*P＜0.05；B：Western印迹检测HeLa细胞中用miRNA表达载体过表达miR-138、miR-34a和miR-21后各自对应靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的蛋白表达水平

3 讨论

图5 敲低HeLa细胞中p53的表达后过表达miR-138、miR-34a和miR-21对靶基因表达水平的影响A：实时荧光定量PCR检测用siRNA沉默p53的mRNA表达水平；B：Western印迹检测用siRNA沉默p53的蛋白表达水平；C：实时荧光定量PCR检测过表达miR-138、miR-34a和miR-21后各自对应靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的mRNA表达水平；D：实时荧光定量PCR检测过表达miR-138、miR-34a和miR-21后的miRNA表达水平；E：Western印迹检测过表达miR-138、miR-34a和miR-21后Cyclin D3、CDK2、PTEN的蛋白表达水平

从最初发现miR-34家族作为p53的直接调控因子以来[12,14-15]，miRNA参与的p53信号通路便得到研究者的广泛关注。在miRNA参与的p53信号通路中，p53可以上调miRNA的表达。为了验证表达野生型p53的细胞中，p53是否可促进miRNA表达，我们将p53保守结合位点构建到miRNA表达载体中，希望借此进一步探讨p53与miRNA的调控关系。

图6 H1299细胞中miR-138、miR-34a和miR-21对靶基因的作用

在表达野生型p53的HeLa细胞中转染带有p53结合位点的miRNA表达载体后，能够有效上调miR-138、miR-34a和miR-21的表达。在p53缺失型的H1299细胞中，转染带有或不带有p53结合位点的miRNA表达载体，miR-138、miR-34a和miR-21的表达量并无明显变化；将p53真核表达载体与带有p53结合位点的miRNA表达载体共转染H1299细胞，则能极大地促进miR-138、miR-34a和miR-21的表达。我们同时选用已有文献报道的miR-138、miR-34a和 miR-21靶基因 Cyclin D3、CDK2和PTEN，检测所构建的载体是否能够有效发挥基因调控功能，发现Cyclin D3、CDK2和PTEN的蛋白表达水平与mRNA水平结果是一致的。

综上所述，我们构建了含有p53结合位点的miRNA表达载体，并通过miR-138、miR-34a、miR-21及其靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN进行了实验验证，证实转染含有p53结合位点的miRNA表达载体后，与商业化miRNA表达载体相比，在表达野生型p53的HeLa细胞中可以提高miRNA的表达效率，而在p53缺失型H1299细胞中我们的改构载体与商业化载体的表达效率没有明显差异。这表明在表达野生型p53的细胞中，利用我们构建的载体可以更高效地促进miRNA及其对相应靶基因的调控。同时，我们可以利用该载体来初步验证细胞是否具有p53转录活性，这对研究p53-miRNA信号通路具有重要意义。

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