黄翅大白蚁后肠降解滤纸微生物群落的分析

员 超，张 宁，倪金凤

(山东大学 微生物技术国家重点实验室，济南 250100)

木质纤维素是地球上储量最为丰富的可再生资源，为生物能源的利用提供了材料［1－3］。按照白蚁肠道后肠有无原生动物将其分为低等白蚁和高等白蚁［4］。黄翅大白蚁是一种高等培菌白蚁，其后肠中含有大量微生物，包括细菌、真菌及古菌，这些共生微生物与宿主白蚁组成高度进化的共生体系，可在木质纤维素降解中共同发挥作用［5］。对白蚁肠代谢环境及从中分离的微生物方面的研究表明，肠道共生微生物能为白蚁提供消化酶以及排毒酶类，并可在氮循环方面起重要作用［6］，同时保护宿主白蚁免受病原体的侵入［7］。

对低等白蚁的研究已经证实:肠道中微生物具有极高的多样性［3，8］，而且存在大量未培养微生物［9］。高等白蚁肠道微生物多样性的研究较为有限，并且高等白蚁如何利用肠道微生物协助木质纤维素的降解依然不清楚。为更好地了解高等白蚁肠道微生物组在木质纤维素降解过程中所发挥的作用，笔者以黄翅大白蚁为材料，通过对后肠微生物的条件培养，了解肠道微生物组在纤维素降解中参与木质纤维素降解作用的可能性，同时利用变性梯度凝胶电泳方法对此环境中的微生物群落进行分析，鉴定此环境的微生物群落结构，进一步了解黄翅大白蚁纤维素的降解机制，以期为生物质能源的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与质粒

在超净台无菌条件下将50只黄翅大白蚁工蚁解剖获得后肠，用研磨棒研磨作为后肠微生物组材料;所用感受态为自制大肠杆菌感受态E.coli DH5α;测序载体为质粒pMD18T vector，Takara公司。

1.1.2 培养基基础(basic media，BM)培养基参照文献［10］。BM+羧甲基纤维素钠(CMC)培养基:在BM培养基的基础上，加入0.5%CMC。

BM-Ac(acetate)+filter paper(BF)培养基:在无NaAc的BM培养基中加入4条1 cm ×5 cm Whatman No.3滤纸(GE公司)。

1.1.3 主要器材

恒温水浴摇床(哈尔滨东联电子科技有限公司);台式离心机(Eppendorf公司);PCR仪、变性梯度凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司);电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 培养过程

首先将黄翅大白蚁后肠微生物材料以1%接种到5 mL BM+CMC的培养基中，30℃富集培养1 d，之后以1%的接种量转接至BF培养基中，每天记录滤纸降解情况。

1.2.2 酶活性电泳

提取此滤纸降解环境的总蛋白，并进行如下的活性电泳实验:①内切葡聚糖酶活性电泳。配制12%SDS-PAGE蛋白胶，在分离胶中添加0.1%CMC，提取的蛋白试样不煮沸，直接上样。按照“先20 mA、30 min，后 30 mA、50 min”的条件进行电泳，电泳结束后，用于内切葡聚糖酶(EG)分析的分离胶先在10 mmol/L、pH 5.5醋酸钠缓冲液(SAB)中浸泡30 min，然后0.1%刚果红染色30 min，1 mol/L NaCl脱色30 min，有EG酶活性的位置将出现1条清晰透明条带。②β-葡萄糖苷酶活性电泳。提取的蛋白试样在上样前不要煮沸，然后在12%SDS-PAGE中电泳，电泳缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸，按照同上条件进行电泳。电泳结束后，用于β-葡糖苷酶(BG)活性分析的分离胶在室温下先用0.1 mol/L SAB缓冲液预处理30 min，再浸没在3 mmol/L 4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡糖苷(MUG)中20～30 min，最后在紫外线下检测BG酶所在位置的荧光信号。③木聚糖酶活性电泳。配制蛋白胶时，在分离胶中添加0.1% 山毛榉木聚糖，提取的蛋白试样在上样前不要煮沸，然后在12%SDSPAGE中电泳。电泳结束后，用于木聚糖酶分析的分离胶在25%异丙醇磷酸盐溶液洗涤40 min，再用磷酸盐溶液洗涤3次，每次15 min，接着在磷酸盐溶液中37℃反应90 min，然后用0.5%刚果红溶液染色20 min，最后用1 mol/L NaCl溶液脱色。

1.2.3 总基因组的提取

采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法提取群落总基因组。①离心后向沉淀中加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 mL Eppendorf管中;②加入800 μL的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB在65℃水浴预热)，每5 min轻轻振荡几次，20 min后12 000 r/min离心15 min;③小心吸取上清液，加入等体积的酚和氯仿溶液各 400 μL，混匀，4℃、12 000 r/min离心10 min;④小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃、12 000 r/min离心10 min。重复步骤④1～2次，以蛋白层不出现为止。取上清，－20℃沉淀1 h，4℃、12 000 r/min离心10 min;弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次;室温下干燥5～15 min后，溶于30～50 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)去离子水中，于－20℃或者－70℃下保存备用。

1.2.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

利用提取的全基因组进行PCR扩增，分析细菌多样性用的引物:341f-GC:5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3';518r:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。扩增真菌用的引物:GC Fung:5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3';NS1:5'-GTAGTCA-TATGCTTGTCTC-3'。PCR程序如下:95℃ 5 min;接着进行20个循环(94℃ 30 s，65～55℃ 30 s)，每循环降0.5℃，72℃ 1 min;然后15个循环(94℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min);最后72 ℃ 5 min。扩增后，进行DGGE实验。细菌多样性实验参数如下:丙烯酰胺质量分数8%，变性剂质量分数40% ～60%，45 V电压下电泳17 h;真菌多样性实验参数如下:丙烯酰胺质量分数6%，变性剂质量分数20%～40%，70 V电压下电泳13 h。电泳结束后，切除条带，将DNA片段从凝胶中溶出，以去除GC-clamp的引物再次进行 PCR，对扩增片段纯化后，连接pMD18T vector，进行测序及比对分析。

2 结果与讨论

2.1 黄翅大白蚁后肠微生物群落对滤纸的降解作用

解剖获得的黄翅大白蚁微生物经过富集培养后，转入以滤纸为唯一C源的BF培养基中，30℃培养，开始时滤纸完好，随着培养天数的增加，滤纸逐渐分解成碎片，培养液开始变浑浊，至7 d后，可以明显观察到微生物对Whatman No.3的降解状况，如图1所示。由图1可见:与对照组相比，实验组溶液呈现明显浑浊，培养基中充满了丝絮状的纤维，培养基中的滤纸被降解成小块;而对照组溶液清晰透明，滤纸条带形状完整。

图1 黄翅大白蚁后肠微生物对Whatman No.3滤纸的降解Fig.1 Digestion of Whatman No.3 filter paper by microbiome of M.barneyi

Warnecke等［11］利用高通量测序的方法对白蚁属后肠P3区进行研究，发现含有高多样性的微生物群落，并且检测到来自于45个糖苷水解酶家族(cazy family，carbohydrate-active enzymes)的糖苷水解酶催化域，表明其后肠微生物可能参与纤维素的降解。通过利用基本盐培养基对黄翅大白蚁后肠微生物的培养，使得微生物组得以利用唯一C源滤纸而生长起来，进一步证实了后肠微生物组在协助宿主白蚁降解结晶纤维素方面可能起到一定的协助作用。

2.2 微生物群落的酶谱分析

为了解微生物在白蚁木质纤维素降解方面起的作用，已有研究者利用分子生物学方法，发现了白蚁肠道中细菌来源的木质纤维素水解酶［12－14］。但白蚁后肠微生物在降解纤维素不同底物方面，尚缺乏直接证据。为此，通过黄翅大白蚁微生物群落对滤纸的降解培养，利用酶谱分析的方法，检测环境中纤维素降解酶的存在情况。提取此环境的总蛋白，经过一定程度的浓缩后，进行酶谱分析，结果如图2所示。

从图2(a)可见，此环境中检测到了2条相对分子质量较大的具有内切葡聚糖酶活性的条带(箭头标出)。为了更好地了解黄翅大白蚁肠道中微生物对纤维素的降解作用，培养基中只含有基本盐类，滤纸是唯一C源，营养较为贫瘠，所以微生物群落的浓度相对比较低，酶谱分析检测到的信号不是很强。同时检测到了相对分子质量大小在4.5×103左右的β-葡萄糖酶活性条带，且条带较为清晰。木聚糖酶活性条带较为清晰，对木聚糖酶的酶谱分析显示了木聚糖酶的存在。白蚁降解半纤维素需要半纤维素酶类，但目前为止还没有白蚁自身来源的半纤维素酶的报道［15］。由此可知，白蚁肠道微生物在半纤维素降解方面可能起到重要作用。黄翅大白蚁后肠微生物具有独立降解纤维素的能力，酶谱分析实验证实了此群落具有纤维素降解功能的内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的存在。

2.3 黄翅大白蚁后肠滤纸降解微生物群落结构的鉴定

通过限定条件培养和酶谱分析的实验已经证实:黄翅大白蚁后肠微生物组能够在营养匮乏的环境中对滤纸行使降解作用，为了进一步探究此纤维素降解环境中发挥作用的微生物种类，接下来利用DGGE的方法对微生物的群落结构进行鉴定，结果如图3所示。

图2 黄翅大白蚁后肠降解滤纸微生物的全蛋白和酶活性电泳Fig.2 Activity electrophoresis of filter paper-hydrolyzing microbiome of M.barneyi hindgut

图3 黄翅大白蚁后肠纤维素降解微生物群落结构的鉴定Fig.3 DGGE profiles of 16S rRNA and 18S rRNA gene amplified from filter paper digestion community of M.barneyi

由图3可知:此环境中含有7种细菌(图3(a))，3种真菌(图3(b));从数量上看，细菌的数量远大于真菌数量，暗示细菌在滤纸降解中发挥了重要作用。为鉴定菌种，DGGE胶上的条带被切割下，DNA从胶内溶出，再次进行PCR，产物经纯化后连接T-载体，并测序。得到的序列信息在NCBI网站上进行比对，以确定此环境中微生物的种类。7种细菌种类如下:1～7分别来自于芽胞杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、变形杆菌属(Proteobacterium)、变形杆菌属(Proteobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)和微杆菌属(Microbacterium)。Baird等［16］研究发现，Bacillus具有纤维素降解所需的内切葡聚糖酶［16］。Bacillus属微生物在白蚁中具有较高多样性，并在白蚁木质纤维素降解的初级阶段中发挥作用，同时某些芽胞杆菌具有降解芳香化合物的能力［17－18］。来源于变形菌属的微生物对昆虫消化道内碳循环有重要作用。在海洋蛀木虫肠道内，来源于变形杆菌属的微生物Teredinibacter turnerae基因组中含有101个糖苷水解酶家族 (GHs)和117个碳水化合物结合结构域(CBMs)［19］，表明其在纤维素降解方面与昆虫的协同作用。此外在微杆菌属中，也有葡萄糖苷酶的报道［20］。对3种真菌进行鉴定，1～3分别来自白地霉属(Galactomyces)、糞壳菌属(Sordariomycetidae)和白地霉属(Galactomyces)。Baffi等［21］对橄榄生态系统进行研究，发现了来自白地霉的真菌，并对该真菌进行酶活性分析，表明具有β-葡萄糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶以及脂酶活性;同时在咖啡残渣的具有纤维素降解能力的微生物中也发现了来源于白地霉属的真菌［22］。因此，通过酶谱分析检测到的纤维素降解酶类可能由上述微生物提供，并协助黄翅大白蚁完成木质纤维素的降解过程，但尚不能确定具体由哪种微生物提供了纤维素降解酶。本研究通过黄翅大白蚁后肠滤纸降解微生物的群落结构鉴定，初步确定了在此环境中起纤维素降解作用的微生物种类，但这些微生物是如何行使降解功能的，以及不同微生物之间的相互关系如何，仍需要进一步研究。

3 结论

初步研究了黄翅大白蚁后肠降解滤纸的微生物群落，对此微生物群落进行酶谱分析，直观地证明了此环境中纤维素及半纤维素降解酶的存在。利用变性梯度凝胶电泳的方法对环境微生物群落结构进行鉴定，确定了此环境中起作用的主要微生物组成。

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