谷氨酸棒状杆菌厌氧产丁二酸的发酵条件

贾全栋，刘学胜，郭燕风，徐建中，张伟国

(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122)

丁二酸又称琥珀酸、二元羧酸，其作为C4平台化合物，在食品、医药、表面活性剂、洗涤剂、绿色溶剂、生物可降解塑料和动植物生长刺激物等领域有广泛的应用前景［1］。化学法生产丁二酸成本高，对环境污染严重［2］，抑制了其作为大宗化学品的发展潜力;生物法生产丁二酸具有低成本、污染小的优点，越来越受到人们的重视［3］。

谷氨酸棒状杆菌是一种生长快、好氧和不产芽胞的革兰氏阳性微生物。在O2充足条件下，以葡萄糖为原料，发酵生产各种氨基酸［4－5］;在厌氧条件下，谷氨酸棒状杆菌不生长，但可以转化葡萄糖为乳酸、丁二酸和乙酸等物质［6－7］。谷氨酸棒状杆菌生物转化法生产丁二酸，主要是通过三羧酸循环途径(TCA)的还原支路，将糖酵解途径(EMP)中得到的磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸经过一步CO2固定和两步还原反应生成丁二酸，该过程涉及的关键酶主要有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶和琥珀酸脱氢酶［8］。

本文中，笔者研究温度和NaHCO3等环境条件对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh产丁二酸的影响，通过代谢流分析比较原始菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032与ATCC13032Δldh在厌氧条件下的代谢流分布情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh(工业生物技术教育部重点实验室构建并保藏)。

1.1.2 主要试剂及仪器

葡萄糖(食品级)，山东西王集团;玉米浆，潍坊金玉米有限公司;高效液相色谱仪，美国Dionex公司;SBA-40C生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所;冷冻离心机，美国Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基

种子培养基(g/L):葡萄糖25，玉米浆30，尿素6.0，K2HPO4·3H2O 2.0，MgSO4·7H2O 0.6;pH 7.2。0.1 MPa灭菌20 min。

发酵培养基(g/L):葡萄糖 70，KH2P041.0，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.6，MnSO4·4H2O 0.02，FeSO4·7H2O 0.02，VB10.000 2，VH0.000 2;pH 6.5。0.07 MPa灭菌10 min，发酵过程中间歇性补加NaHCO3。

1.2.2 培养方法

种子液培养方法:挑取活化后的菌种接入装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，在31℃、100 r/min条件下培养10 h。

将种子液离心(6 000 r/min、4 ℃、10 min)，收集菌体，然后用发酵培养基将菌体重新悬浮成菌悬液;干菌体质量浓度40 g/L，将菌悬液接种到31℃有盖子的瓶子中厌氧转化36 h，转化过程间歇性补加NaHCO3。

1.2.3 菌体生长曲线测定

将样品用蒸馏水稀释26倍，在610 nm波长下测量吸光度(A610)。

1.2.4 菌体干质量测定

称出100 mL离心管的质量(m1)，取50 mL种子液置于离心管中，6 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤2次，于105℃烘箱中干燥至恒质量后称质量(m2)，菌体干质量 =m2－m1。

1.2.5 样品处理

发酵结束后，收集发酵液6 000 r/min离心，上清液用蒸馏水稀释10倍后用于有机酸含量测定。

1.2.6 葡萄糖、有机酸含量的测定

葡萄糖含量利用SBA-40C生物传感反应仪(山东省科学院生物研究所)测定;有机酸含量测定［9］:采用高效液相色谱法(戴安Dionex P680系列)，色谱柱为COSMOSIL反相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为体积分数0.5%乙腈－20 mmol/L KH2PO4溶液，pH 2.5，流速 0.5 mL/min，进样体积10 μL，柱温25℃，紫外检测器检测，检测波长为210 nm。

1.2.7 谷氨酸棒状杆菌厌氧产酸代谢流分析方法

代谢流分析(MFA)是代谢工程中用以指导遗传操作的重要工具，是代谢网络定量分析的基本方法之一［10］。MFA根据胞内主要反应构建的代谢网络模型和胞内代谢产物的质量平衡来计算物质代谢流分布情况，对于理解细胞的代谢调控机制具有重要意义。根据文献［11］以及发酵实验分析，建立了谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为C源，在厌氧条件下合成丁二酸的代谢网络，如图1所示。主要包括糖酵解途径、部分TCA途径、C3、C4的合成途径。代谢流平衡模型的建立:代谢节点处反应速率方程见表1。方程组由4个方程构成，8个未知数，通过测定厌氧转化反应速率确定代谢网络流量分配，在谷氨酸棒状杆菌厌氧转化前期(0～6 h)离线测定葡萄糖、乳酸、丁二酸和乙酸的浓度。在谷氨酸棒状杆菌厌氧代谢过程中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶对CO2的固定起主要作用，占有主导地位，丙酮酸羧化酶的敲除对菌株产生丁二酸没有影响［12］，因此以J6=0，作为已知参量，代入上述代谢速率平衡方程组，通过以上数据可以计算代谢流分布。在代谢流的计算中，均以100 mmol/(L·h)的葡萄糖为计算基准，所有代谢流量的单位均为mmol/(L·h)。

基于以下原则建立代谢网络［13］:①代谢流分析是基于拟稳态假设基础上的分析方法;②反应途径中消耗的NADH与代谢产生的NADH总数相等，即NADH供需平衡;③忽略乙醛酸循环，不考虑EMP途径;④按固定比例进行的反应及无分支点的中间反应，尽量简化为一个反应方程;⑤细胞生长停滞阶段，由于大量无效循环的存在，所以不考虑ATP总量的平衡。

图1 谷氨酸棒状杆菌厌氧代谢流量分布Fig.1 Metabolic flux distribution of C.glutamicum under anaerobic condition

表1 代谢节点反应速率方程Table 1 Reaction rate equation of metabolic nodes

2 结果与讨论

2.1 乳酸脱氢酶基因敲除对谷氨酸棒状杆菌生长的影响

测定菌株的生长曲线，每2 h取样，绘制生长曲线，见图2。由图2可知，菌株ATCC13032Δldh和原始菌株进入对数生长期和稳定期时间是一致的，但最终敲除菌的生物量比原始菌明显减少，说明乳酸脱氢酶基因的敲除对菌株生长上有一定的负面影响。

图2 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032及其突变株ATCC13032Δldh的生长曲线Fig.2 Growth curves of C.glutamicum ATCC13032 and C.glutamicum ATCC13032Δldh

2.2 碳酸盐对丁二酸产量的影响

在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh转化葡萄糖产丁二酸过程中，主要通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶固定CO2生成丁二酸的前体物质草酰乙酸。碳酸盐对丁二酸产量的影响见图3。由图3可知:在pH 8.0条件下，发现补加NaHCO3的效果最好，丁二酸产量为33.2 g/L;而补加CaCO3和Na2CO3，丁二酸产量很低。

图3 碳酸盐对丁二酸产量的影响Fig.3 Effects of different kinds of carbonates on succinic acid production by C.glutamicum ATCC13032Δldh

2.3 NaHCO3质量浓度对厌氧转化的影响

NaHCO3作为CO2的来源，对于丁二酸厌氧转化非常重要［14］。考察NaHCO3的添加量对代谢的影响，一次性添加不同质量浓度(0、10、20、30、40 和50 g/L)NaHCO3，初始pH 8.0，厌氧转化20 h，结果如表2所示。

由表2可知:NaHCO3的浓度影响葡萄糖转化速率，在0～50 g/L的范围内，NaHCO3的浓度越高，葡萄糖的转化速率越快;NaHCO3的浓度也影响代谢流的分布，NaHCO3浓度低时，代谢流较多流向丙酮酸，转化为大量乙酸。随着NaHCO3浓度的提高，流向丁二酸的代谢流增加，NaHCO3浓度的增加使葡萄糖更多地转化为丁二酸，丁二酸与乙酸的摩尔比增加。但是添加50 g/L NaHCO3，丁二酸浓度降低，丁二酸与乙酸的摩尔比也有所降低，说明过高的NaHCO3对菌体转化造成抑制，NaHCO3不仅是丁二酸的合成来源，也是影响厌氧代谢流向的重要因素，因此在厌氧转化过程中必须合理补加NaHCO3。

表2 NaHCO3浓度对厌氧代谢的影响Table 2 Effects of bicarbonate on Anaerobic metabolism by C.glutamicum ATCC13032Δldh

2.4 温度对厌氧转化的影响

微生物的产物合成需要在合适的温度下进行，温度对微生物的影响是多方面的，如酶活、传质等方面。温度对发酵的影响是各种因素综合变化的结果，因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境［15］。笔者考察温度对丁二酸转化的影响，结果如图4所示。由图4可知:随着温度的升高，丁二酸质量浓度不断增加，当温度达到33℃后，再升高温度，丁二酸质量浓度反而有所下降。所以，选取33℃作为丁二酸发酵的最佳温度。

图4 温度对丁二酸产量的影响Fig.4 Effects of temperature on succinic acid production by C.glutamicum ATCC13032Δldh

2.5 代谢流分析

代谢流分析可以直观地反映不同途径的相互作用以及围绕代谢分支点的物质流分布，进而表征细胞的代谢能力［16］。通过研究谷氨酸棒状杆菌厌氧代谢转化葡萄糖前期的代谢流，分析乳酸脱氢酶基因敲除对代谢流分布的影响。对厌氧转化前期(0～6 h)代谢流量进行分析，选择0和6 h离线测定葡萄糖、丁二酸、乙酸和乳酸的浓度。代谢流量分布情况如图5所示。

图5 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032与ATCC13032Δldh厌氧代谢流量分布比较Fig.5 Comparison of metabolic flux distribution between C.glutamicum ATCC13032 and ATCC13032Δldh

从图5可以看出:乳酸脱氢酶基因的敲除对谷氨酸棒状杆菌的代谢流有很大影响，流向乳酸的代谢流变为0，流向丁二酸的代谢流大幅提高，乳酸脱氢酶基因敲除导致PEP生成丁二酸的代谢流增加了214.3%。PEP和Pyr是代谢流中的关键节点，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶将PEP转化为丁二酸，流向丙酮酸的代谢流转化为乙酸。乳酸脱氢酶基因敲除导致流向乳酸的代谢流为0，经过酶活测定谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh的乳酸脱氢酶活性为0(数据未显示)，说明谷氨酸棒状杆菌在厌氧条件下没有其他的途径产生乳酸，乳酸脱氢酶没有其他的同工酶。

2.6 分批发酵实验结果

通过实验对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh厌氧转化过程进行分析，添加90 g/L葡萄糖的发酵液，干菌体质量浓度40 g/L，温度33℃，500 mL厌氧瓶装液100 mL，转化过程中取样分析葡萄糖和有机酸浓度变化，结果如图6所示。由图6可知:经过36 h的厌氧转化，丁二酸质量浓度41.2 g/L，转化率达到45.0%，产酸速率1.14 g/(L·h)，较原始菌株有大幅提高。

图6 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh厌氧分批转化过程曲线Fig.6 Batch bioconversion curves of organic acid production under oxygen deprivation conditions

3 结论

谷氨酸棒状杆菌厌氧转化葡萄糖产丁二酸过程中，补加NaHCO3，丁二酸的产量最高。NaHCO3不仅影响葡萄糖转化速率和丁二酸生成速率，而且影响丁二酸与乙酸生成的摩尔比。最佳转化温度是33℃。乳酸脱氢酶基因敲除对谷氨酸棒状杆菌代谢流分布有很大影响，流向丁二酸的代谢流提高了214.3%，流向乳酸的代谢流为0。在以上条件控制下谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh分批转化36 h，产丁二酸41.2 g/L，转化率45.0%，较原始菌株有很大提高。

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